Un contrasto di tre tecniche di inoculazione utilizzate per determinare la razza di Fusarium oxysporum sconosciuto f.sp. niveum Isola

Summary

La gestione dell’appassimento del Fusarium dell’anguria richiede la conoscenza delle razze patogene presenti. Qui, descriviamo il root-dip, la semina del kernel infestato e i metodi di inoculazione a immersione del vassoio modificati per dimostrare la loro efficacia nella tipizzazione della razza del fungo patogeno Fusarium oxysporum f. sp niveum (Fon).

Abstract

L’appassimento del fusarium dell’anguria (Citrullus lanatus), causato dal Fusarium oxysporum f. sp. niveum (Fon), è riemerso come un importante vincolo di produzione nel sud-est degli Stati Uniti, in particolare in Florida. L’implementazione di strategie di gestione integrata dei parassiti, come le cultivar resistenti specifiche per razza, richiede informazioni sulla diversità e la densità di popolazione dell’agente patogeno nei campi dei coltivatori. Nonostante alcuni progressi nello sviluppo di strumenti diagnostici molecolari per identificare gli isolati di patogeni, la determinazione della razza richiede spesso approcci di biodosaggio.

La tipizzazione della razza è stata condotta mediante inoculazione root-dip, metodo di semina del kernel infestato e metodo di immersione del vassoio modificato con ciascuno dei quattro differenziali di anguria (Black Diamond, Charleston Grey, Calhoun Grey, Plant Introduction 296341-FR). Agli isolati viene assegnata una designazione di razza mediante il calcolo dell’incidenza della malattia cinque settimane dopo l’inoculazione. Se meno del 33% delle piante per una particolare cultivar erano sintomatiche, sono state classificate come resistenti. Quelle cultivar con incidenza superiore al 33% sono state considerate sensibili. Questo articolo descrive tre diversi metodi di inoculazione per accertare la razza, il root-dip, il kernel infestato e l’inoculazione a vassoio modificato, le cui applicazioni variano a seconda del disegno sperimentale.

Introduction

I funghi terrestri che compongono il complesso di specie Fusarium oxysporum (FOSC) sono patogeni emibiotrofici di impatto che possono causare gravi malattie e perdita di resa in una vasta gamma di colture¹. L’appassimento del fusarium dell’anguria, causato da F. oxysporum f. sp. niveum (Fon), è aumentato in portata, incidenza e gravità in tutto il mondo negli ultimi decenni ^2,3. Nelle piantine, i sintomi dell’appassimento di Fusarium spesso assomigliano allo smorzamento. Nelle piante più vecchie, il fogliame diventa grigio, clorotico e necrotico. Alla fine, l’avvizzimento delle piante progredisce fino al collasso completo delle piante e alla morte⁴. La perdita diretta di resa si verifica a causa dei sintomi e della morte delle piante, mentre la perdita di resa indiretta può verificarsi a causa dei danni del sole causati dall’eliminazione della chioma fogliare⁵. La riproduzione sessuale e le strutture riproduttive associate non sono mai state osservate in F. oxysporum. Tuttavia, l’agente patogeno produce due tipi di spore asessuate, micro e macroconidi, nonché strutture di sopravvivenza più grandi e a lungo termine chiamate clamidospore, che possono sopravvivere nel terreno per molti anni⁶.

Il FOSC è classificato in formae speciales in base agli intervalli di ospiti osservati, di solito limitati a una o poche specie ospiti¹. Sebbene recenti ricerche abbiano indicato che questo complesso di specie può essere un composto di 15 specie diverse, le specie particolari che infettano l’anguria sono attualmente sconosciute⁷. F. oxysporum f. sp. niveum (Fon) è il nome dei gruppi di ceppi che infettano esclusivamente il Citrullus lanatus o l’anguria addomesticata ^8,9. I ceppi di F. oxysporum all’interno della maggior parte delle forme specialis patogene mostrano determinati livelli di diversità per quanto riguarda le loro componenti genetiche e la virulenza nei confronti di una specie ospite. Ad esempio, un ceppo può infettare tutte le cultivar di un ospite, mentre un altro può infettare solo le cultivar più sensibili. Per spiegare tale variazione, questi gruppi sono informalmente classificati in razze basate su relazioni evolutive o caratteristiche fenotipiche comuni. All’interno di Fon, quattro razze (0, 1, 2 e 3) sono state caratterizzate in base alla loro patogenicità rispetto a una serie di cultivar di anguria selezionate, con la scoperta della razza 3 che si è verificata recentemente¹⁰.

Nonostante questa apparente diversità, le morfologie delle spore o delle ife non sono distinguibili tra le razze delle razze Fon, il che significa che sono necessari saggi molecolari o fenotipici per identificare la razza unica di un isolato¹¹. La ricerca molecolare ha identificato alcune differenze genetiche. Ad esempio, il ruolo degli effettori Secreted in Xylem (SIX) è stato studiato per anni in F. oxysporum e alcuni di questi effettori sono stati localizzati sui cromosomi scambiati durante il trasferimento genico orizzontale¹². Ad esempio, SIX6 si trova nelle gare Fon 0 e 1 ma non in gara 2¹³. SEI effettori sono stati implicati nella patogenicità di F. oxysporum f. sp. lycopersici e F. oxysporum f. sp. cubense, che causano l’appassimento di Fusarium su pomodoro e banana, rispettivamente 14,15,16,17. L’analisi dei profili effettori SIX tra ceppi di F. oxysporum f. sp. spiniciae, il patogeno appassito di Fusarium sugli spinaci, ha consentito una classificazione che riflette accuratamente la diversità genetica e fenotipica¹⁸. Tuttavia, le differenze tra i meccanismi di virulenza delle razze Fon non sono attualmente del tutto comprese, e i saggi molecolari sviluppati sul loro uso hanno mostrato risultati incoerenti e imprecisi¹⁹. Pertanto, i risultati fenotipici dei test di infezione sono attualmente il modo migliore per classificare gli isolati.

F. oxysporum inizialmente infetta gli ospiti attraverso le radici prima di farsi strada nello xilema²⁰. Ciò rende l’inoculazione diretta delle radici di una determinata cultivar ospite un modo efficace per eseguire la tipizzazione della razza ed è alla base dei metodi di inoculazione root-dip e tray-dip²¹. Quando non infetta un ospite, F. oxysporum risiede nel terreno e può rimanere dormiente per anni. Coltivare cultivar di anguria sensibili nel terreno da un campo di interesse è un modo per testare la presenza di Fon. Espandere questo metodo per includere cultivar di diversi livelli noti di resistenza nel terreno che è deliberatamente infestato con Fon è anche un buon modo per eseguire la tipizzazione della razza (Tabella 1) ed è la base del metodo di semina del nocciolo infestato. Il metodo di immersione del vassoio modificato è una variante del metodo originale del vassoio-immersione che consente una tipizzazione della corsa ad alta produttività in cui molte piante e isolati di campo possono essere studiati rapidamente²². Fattori importanti di un biotest rapido e di successo includono l’uso di cultivar che hanno differenze documentate nella resistenza alle diverse razze patogene, assicurando che l’inoculo sia biologicamente attivo che abbondante durante l’infezione, mantenendo un ambiente favorevole sia per l’agente patogeno che per l’ospite e utilizzando un sistema di valutazione coerente per gravità o incidenza della malattia. Questo articolo descrive i metodi root-dip^23,24, la semina del kernel infestata^25,26 e i metodi di tray-dip²² modificati per la tipizzazione fenotipica della razza basata sui principi sopra descritti.

Protocol

1. Determinazione della razza mediante il metodo root-dip (RDM) Preparazione dell’ambiente sperimentale Poiché l’espressione dei sintomi dipende fortemente dalle condizioni ambientali, mantenere le piante in un’area controllata. Monitorare l’umidità relativa, la temperatura, il fotoperiodo e l’intensità della luce (Figura 1). Impostare la temperatura a 26-28 °C, l’umidità relativa al 50-75% e impostare un fotoperiodo di 16 ore per garantire un’…

Representative Results

Questi esperimenti aiutano a definire la resistenza relativa delle cultivar comunemente coltivate (Tabella 1). Queste informazioni possono quindi essere utilizzate per guidare le raccomandazioni di gestione basate sulle popolazioni Fon locali. In altre parole, se la razza 0 o 1 è nota per essere presente in un campo commerciale, allora l’agricoltore può essere incline a coltivare una varietà “resistente” come Calhoun Gray, Sunsugar o equivalente. I risultati dei biosaggi che utilizzano tutti i metodi …

Discussion

Sono stati presentati tre metodi di tipizzazione della razza. Ognuno di questi metodi è più adatto a particolari domande e condizioni sperimentali. Il metodo di inoculazione del kernel infestato (infestazione del suolo) è forse più semplice e diretto, rendendolo particolarmente utile per la valutazione della patogenicità³⁰. L’uso di questo metodo per la semplice digitazione della razza è altamente efficace. Tuttavia, applicare il metodo per determinare la resistenza di una cultivar specifica…

Materials

100% Fuller’s Earth	Sigma-Aldrich	F200-5KG
1 L glass Erlenmeyer Flask	PYREX	4980-1L
15 mL falcon tubes	Fisher Scientific	14-959-49B
50 mL graduated cylinder	Lab Safety Supply	41121805
50 mL Eppendorf Conical Tubes	Fisher Scientific	05-413-921
Aluminum foil wrap	Reynolds Wrap	720
Bleach	Walmart	587192290
Bunsen burner	Fisher Scientific	03-391-301
CaCO3	sigma-Aldrich	239216
cell spreaders	Fisher Scientific	08-100-11
Cheesecloth	Lions Services, Inc	8305-01-125-0725
Clear plastic dishes	Visions Wave	999RP6CLSS	~15 cm diameter
Clear vinyl tubing for mushroom bag clamps	Shroom Supply		6" for small bag, 8" for medium bag, 10" for large bag
Cotton Balls	Fisherbrand	22-456-885	Sterile
Ethanol	Fisher Chemical	A4094	100%, then combine with water to make 70% for use
Flourescent Tube Lights	MaxLume	Model T5	2800 K Color Temperature, 24'' or 48'' long
granulated agar	VWR International	90000-786
Hand-held Spray Bottle	Ability One	24122002	~0.95 L
hemacytometer	Fisher Scientific	02-671-55A	Two chamber hemacytometer
Lab trays	Fisher Scientific	15-236-2A
Large, sealable plastic bags	Ziploc	430805	38 cm x 38 cm
Mister / watering can	Bar5F	B10H22
Mushroom Bag Clamp	Shroom Supply		6" for small bag, 8" for medium bag, 10" for large bag
Nitrile Gloves	Fisher Scientific	19-130-1597D
Organic Rye Berries	Shroom Supply		0.5 gallon or 25 lb bags
P1000 pipette and tips	Fisher Scientific	14-388-100
Petri dishes	Fisherbrand	FB0875713	Round, 100 mm diameter, 15 mm height
Planting media	Jolly Gardener	Pro-Line C/B
Plastic Pitcher	BrandTech	UX0600850	1 L or larger
Plastic planting pots	Neo/SCI	01-1177	~15 cm diameter and ~10 cm height
Plastic, autoclave-safe bin	Thermo Scientific	UX0601022	3 L
Quarter-strength potato dextrose agar media	Cole-Parmer	UX1420028	Use powder in combination with recipe for QPDA
Scientific Balance Scale, measuring in g	Ohaus	30208458	Any precise scale that can hold and measure 200g will work
Size #4 cork bore	Cole-Parmer	NC9585352
Small Mushroom grow bag	Shroom Supply		0.5 micron filter, also comes in medium and large sizes
Soil trowel	Walmart	563876946
Styrofoam flats (6 x 12 cells)	Speedling	Model TR72A
Styrofoam flats (8 x 16 cells)	Speedling	Model TR128A
Syringe (5 or 10 mL)	fisher Scientific	14-829-19C
Timer	Walmart	TM-01
V8 Original 100% Vegetable Juice	Walmart	564638212
vortex	Fisher Scientific	02-215-418
Watermelon Seed – Black Diamond	Willhite Seed Inc	17
Watermelon Seed – Calhoun Gray	Holmes Seed Company	4440
Watermelon Seed – Charleston Gray	Bonnie Plants	7.15339E+11
Watermelon Seed – PI 296341-FR	Contact authors	Contact authors
Wheat Kernels (Maxie var.) (optional)	Alachua County Feed & Seed