JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Biologia

En kontrast av tre inokulasjonsteknikker som brukes til å bestemme løpet av ukjent Fusarium oxysporum f.sp. niveum Isolerer

Published: October 28, 2021
doi:
10.3791/63181
, , , , , , , , ,
1Department of Plant Pathology,University of Florida, 2University of Florida Institute of Food and Agricultural Sciences, 3Gulf Coast Research and Education Center,University of Florida, 4Horticultural Sciences Department,University of Florida, 5Tropical Research and Education Center,University of Florida, 6Department of Horticulture,University of Georgia

Summary

Håndtering av Fusarium wilt av vannmelon krever kunnskap om patogenløpene som er tilstede. Her beskriver vi rotdipp, infisert kjernesåing og modifiserte inokulasjonsmetoder for å demonstrere deres effekt i raseskriving av den patogene sopp fusariumoksysporum f. sp niveum (Fon).

Abstract

Fusarium wilt av vannmelon (Citrullus lanatus), forårsaket av Fusarium oxysporum f. sp. niveum (Fon), har reemerged som en stor produksjonsbegrensning i det sørøstlige USA, spesielt i Florida. Distribusjon av integrerte pesthåndteringsstrategier, for eksempel rasespesifikke motstandsdyktige kultivarer, krever informasjon om patogenets mangfold og befolkningstetthet på dyrkerfeltene. Til tross for noen fremskritt i å utvikle molekylære diagnostiske verktøy for å identifisere patogenisolasjoner, krever rasebestemmelse ofte bioassay tilnærminger.

Racemetoden ble utført av root-dip inokulering, infisert kjerne såing metode, og den modifiserte skuff-dip metoden med hver av de fire vannmelon differensialer (Black Diamond, Charleston Grey, Calhoun Grey, Plant Introduction 296341-FR). Isolasjoner tildeles en rasebetegnelse ved beregning av sykdomsforekomst fem uker etter inokulasjon. Hvis mindre enn 33% av plantene for en bestemt kultivar var symptomatiske, ble de kategorisert som motstandsdyktige. De kultivarer med forekomst større enn 33% ble ansett som utsatt. Dette dokumentet beskriver tre forskjellige metoder for inokulasjon for å fastslå rase, rotdipp, infisert kjerne og modifisert skuff-dip inokulasjon, hvis applikasjoner varierer i henhold til eksperimentell design.

Introduction

De jordbårne soppene som utgjør Fusarium oxysporum artskomplekset (FOSC) er virkningsfulle hemibiotrofiske plantepatogener som kan forårsake alvorlig sykdom og gi tap i et mangfoldig utvalg av avlinger1. Fusarium wilt av vannmelon, forårsaket av F. oxysporum f. sp. niveum (Fon), har økt i omfang, forekomst og alvorlighetsgrad over hele verden de siste tiårene 2,3. I frøplanter vil symptomene på Fusarium ofte ligne demping. I eldre planter blir løvet grått, klorotisk og nekrotisk. Til slutt går vanning av plantene til full plantekollaps og død4. Direkte utbyttetap oppstår på grunn av symptomene og plantedøden, mens indirekte utbyttetap kan oppstå på grunn av solskader forårsaket av eliminering av bladtaket5. Seksuell reproduksjon og tilhørende reproduktive strukturer har aldri blitt observert i F. oksysporum. Patogenet produserer imidlertid to typer aseksuelle sporer, mikro- og makroøkonomi, samt større, langsiktige overlevelsesstrukturer kalt chlamydospores, som kan overleve i jorda i mange år6.

FOSC er klassifisert i formae spesialtilbud basert på observerte vertsområder, vanligvis begrenset til en eller noen få vertsarter1. Selv om nyere forskning har indikert at dette artskomplekset kan være en sammensetning av 15 forskjellige arter, er de spesielle artene som infiserer vannmelon for tiden ukjente7. F. oxysporum f. sp. niveum (Fon) er navnet på gruppene av stammer som utelukkende infiserer Citrullus lanatus eller den tamme vannmelonen 8,9. F. oxysporum stammer innenfor de fleste patogene formae spesialiteter viser visse nivåer av mangfold med hensyn til deres genetiske komponenter og virulens mot en vertsart. For eksempel kan en stamme infisere alle kultivarer av en vert, mens en annen bare kan infisere de mer utsatte kultivarer. For å gjøre rede for en slik variasjon, er disse gruppene uformelt klassifisert i raser basert på evolusjonære forhold eller vanlige fenotypiske egenskaper. Innenfor Fon har fire løp (0, 1, 2 og 3) blitt karakterisert basert på deres patogenitet mot et sett med utvalgte vannmelonkulturer, med oppdagelsen av rase 3 som forekommer nylig10.

Til tross for dette tilsynelatende mangfoldet, er morfologiene til sporer eller hyphae ikke skille mellom løpene til Fon-raser, noe som betyr at molekylære eller fenotypiske analyser er nødvendige for å identifisere en isolats unike rase11. Molekylær forskning har identifisert noen genetiske forskjeller. For eksempel har rollen som utskilt i Xylem (SIX) effektorer blitt studert i årevis i F. oksysporum, og noen av disse effektorene har vært plassert på kromosomene som utveksles under horisontal genoverføring12. For eksempel finnes SIX6 i Fon løp 0 og 1, men ikke i løp 213. SEKS effektorer har blitt involvert i patogenisiteten til F. oxysporum f. sp. lycopersici og F. oxysporum f. sp. cubense, som forårsaker Fusarium wilt på tomat og banan, henholdsvis 14,15,16,17. Analysen av SEKS effektorprofiler blant stammer av F. oxysporum f. sp. spiniciae, Fusarium wilt patogen på spinat, har aktivert klassifisering som nøyaktig gjenspeiler genetisk og fenotypisk mangfold18. Forskjellene mellom virulensmekanismer for Fon-løp er imidlertid for tiden ikke helt forstått, og molekylære analyser utviklet ved bruk har vist inkonsekvente og unøyaktige resultater19. Derfor er fenotypiske resultater fra infeksjonsanalyser for tiden den beste måten å klassifisere isolasjoner på.

F. oxysporum infiserer først verter gjennom røttene før de tar seg opp xylem20. Dette gjør direkte inokulering av røttene til en gitt vertskultivar en effektiv måte å utføre race-skriving på og er grunnlaget for rotdipp- og skuff-dip-inokuleringsmetodene21. Når du ikke smitter en vert, ligger F. oxysporum i jorda og kan forbli sovende i årevis. Voksende mottakelige vannmelon kultivarer i jord fra et interessefelt er en måte å teste for tilstedeværelsen av Fon. Å utvide denne metoden til å omfatte kultivarer av forskjellige kjente nivåer av motstand i jord som bevisst er infisert med Fon, er også en god måte å utføre raseskriving (tabell 1) og er grunnlaget for den infiserte kjernesåingsmetoden. Den modifiserte skuffdippmetoden er en variant av den opprinnelige skuffdippmetoden som gir mulighet for en høy gjennomstrømningsløpsskriving der mange planter og feltisolasjoner kan undersøkes raskt22. Viktige faktorer i en rask og vellykket raseskriving bioassay inkluderer bruk av kultivarer som har dokumentert forskjeller i motstand mot de forskjellige patogenløpene, sikre at inoculum er både biologisk aktiv og rikelig under infeksjon, opprettholde et miljø som både bidrar til patogen og vert, og bruker et konsistent vurderingssystem for alvorlighetsgrad eller forekomst av sykdom. Dette dokumentet beskriver rot-dip23,24, infisert kjerne seeding25,26, og modifisert skuff-dip22 metoder for fenotypisk rase-skriving basert på prinsippene beskrevet ovenfor.

Protocol

1. Bestemme rase ved root-dip metode (RDM) Forberedelse av det eksperimentelle miljøet Fordi symptomuttrykk er svært avhengig av miljøforhold, opprettholder du planter i et kontrollert område. Overvåk relativ fuktighet, temperatur, fotoperiod og lysintensitet (figur 1). Sett temperaturen til 26-28 °C, relativ fuktighet til 50-75 %, og sett en fotoperiod på 16 timer for å sikre tilstrekkelig plantevekst og helse.MERK: For å forhindre hyp…

Representative Results

Disse eksperimentene bidrar til å definere den relative motstanden til ofte dyrkede kultivarer (tabell 1). Denne informasjonen kan deretter brukes til å veilede ledelsesanbefalinger basert på lokale Fon-populasjoner. Med andre ord, hvis løp 0 eller 1 er kjent for å være til stede i et kommersielt felt, kan bonden være tilbøyelig til å vokse et “motstandsdyktig” utvalg som Calhoun Gray, Sunsugar eller tilsvarende. Resultatene av bioassayene ved hjelp av alle metoder viser at når plantene ble smi…

Discussion

Tre metoder for raseskriving har blitt presentert. Hver av disse metodene passer best til bestemte spørsmål og eksperimentelle forhold. Den infiserte kjerneinokulasjonsmetoden (jordinfeksjon) er kanskje enklere og enklere, noe som gjør den spesielt nyttig for vurdering av patogenitet30. Å bruke denne metoden for enkel race-skriving er svært effektiv. Det kan imidlertid være utfordrende å bruke metoden for å bestemme motstanden til en bestemt kultivar, gitt at hver plante ikke kan møte sam…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi vil gjerne anerkjenne Dr. Ali og Plant Molecular Diagnostic Laboratory samt Dr. Pingsheng Ji ved University of Georgia, hvis ledelse og støtte bidro til å etablere vårt Fon-program.

Materials

100% Fuller’s Earth Sigma-Aldrich F200-5KG
1 L glass Erlenmeyer Flask PYREX 4980-1L
15 mL falcon tubes Fisher Scientific 14-959-49B
50 mL graduated cylinder Lab Safety Supply 41121805
50 mL Eppendorf Conical Tubes Fisher Scientific 05-413-921
Aluminum foil wrap Reynolds Wrap 720
Bleach Walmart 587192290
Bunsen burner Fisher Scientific 03-391-301
CaCO3 sigma-Aldrich 239216
cell spreaders Fisher Scientific 08-100-11
Cheesecloth Lions Services, Inc 8305-01-125-0725
Clear plastic dishes Visions Wave 999RP6CLSS ~15 cm diameter
Clear vinyl tubing for mushroom bag clamps Shroom Supply 6" for small bag, 8" for medium bag, 10" for large bag
Cotton Balls Fisherbrand 22-456-885 Sterile
Ethanol Fisher Chemical A4094 100%, then combine with water to make 70% for use
Flourescent Tube Lights MaxLume Model T5 2800 K Color Temperature, 24'' or 48'' long
granulated agar VWR International 90000-786
Hand-held Spray Bottle Ability One 24122002 ~0.95 L
hemacytometer Fisher Scientific 02-671-55A Two chamber hemacytometer
Lab trays Fisher Scientific 15-236-2A
Large, sealable plastic bags Ziploc 430805 38 cm x 38 cm
Mister / watering can Bar5F B10H22
Mushroom Bag Clamp Shroom Supply 6" for small bag, 8" for medium bag, 10" for large bag
Nitrile Gloves Fisher Scientific 19-130-1597D
Organic Rye Berries Shroom Supply 0.5 gallon or 25 lb bags
P1000 pipette and tips Fisher Scientific 14-388-100
Petri dishes Fisherbrand FB0875713 Round, 100 mm diameter, 15 mm height
Planting media Jolly Gardener Pro-Line C/B
Plastic Pitcher BrandTech UX0600850 1 L or larger
Plastic planting pots Neo/SCI 01-1177 ~15 cm diameter and ~10 cm height
Plastic, autoclave-safe bin Thermo Scientific UX0601022 3 L
Quarter-strength potato dextrose agar media Cole-Parmer UX1420028 Use powder in combination with recipe for QPDA
Scientific Balance Scale, measuring in g Ohaus 30208458 Any precise scale that can hold and measure 200g will work
Size #4 cork bore Cole-Parmer NC9585352
Small Mushroom grow bag Shroom Supply 0.5 micron filter, also comes in medium and large sizes
Soil trowel Walmart 563876946
Styrofoam flats (6 x 12 cells) Speedling Model TR72A
Styrofoam flats (8 x 16 cells) Speedling Model TR128A
Syringe (5 or 10 mL) fisher Scientific 14-829-19C
Timer Walmart TM-01
V8 Original 100% Vegetable Juice Walmart 564638212
vortex Fisher Scientific 02-215-418
Watermelon Seed – Black Diamond Willhite Seed Inc 17
Watermelon Seed – Calhoun Gray Holmes Seed Company 4440
Watermelon Seed – Charleston Gray Bonnie Plants 7.15339E+11
Watermelon Seed – PI 296341-FR Contact authors Contact authors
Wheat Kernels (Maxie var.) (optional) Alachua County Feed & Seed
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Edel-Hermann, V., Lecomte, C. Current status of Fusarium oxysporum formae speciales and races. Phytopathology. 109 (4), 512-530 (2019).
  2. Everts, K. L., Himmelstein, J. C. Fusarium wilt of watermelon: Towards sustainable management of a re-emerging plant disease. Crop Protection. 73, 93-99 (2015).
  3. Martyn, R. Cucurbitaceae 2012. Proceedings of the Xth EUCARPIA Meeting on Genetics and Breeding of Cucurbitaceae. , 136-156 (2012).
  4. Roberts, P., Dufault, N., Hochmuth, R., Vallad, G., Paret, M. [PP352] Fusarium wilt (Fusarium oxysporum f. sp. niveum) of watermelon. EDIS. 2019 (5), 4 (2019).
  5. Costa, A. E. S., et al. Resistance to Fusarium wilt in watermelon accessions inoculated by chlamydospores. Scientia Horticulturae. 228, 181-186 (2018).
  6. Lombard, L., Sandoval-Denis, M., Lamprecht, S. C., Crous, P. Epitypification of Fusarium oxysporum-clearing the taxonomic chaos. Persoonia: Molecular Phylogeny and Evolution of Fungi. 43, 1 (2019).
  7. Martyn, R. D. Fusarium wilt of watermelon: 120 years of research. Horticultural Reviews. 42 (1), 349-442 (2014).
  8. Zhou, X., Everts, K. Characterization of a regional population of Fusarium oxysporum f. sp. niveum by race, cross pathogenicity, and vegetative compatibility. Phytopathology. 97 (4), 461-469 (2007).
  9. Zhou, X., Everts, K., Bruton, B. Race 3, a new and highly virulent race of Fusarium oxysporum f. sp. niveum causing Fusarium wilt in watermelon. Plant Disease. 94 (1), 92-98 (2010).
  10. Leslie, J. F., Summerell, B. A. . The Fusarium laboratory manual. , (2008).
  11. Lo Presti, L., et al. Fungal effectors and plant susceptibility. Annual Review of Plant Biology. 66, 513-545 (2015).
  12. Niu, X., et al. The FonSIX6 gene acts as an avirulence effector in the Fusarium oxysporum f. sp. niveum-watermelon pathosystem. Scientific Reports. 6 (1), 1-7 (2016).
  13. Lievens, B., Houterman, P. M., Rep, M. Effector gene screening allows unambiguous identification of Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici races and discrimination from other formae speciales. FEMS Microbiology Letters. 300 (2), 201-215 (2009).
  14. Houterman, P. M., Cornelissen, B. J., Rep, M. Suppression of plant resistance gene-based immunity by a fungal effector. PLoS Pathogens. 4 (5), 1000061 (2008).
  15. Houterman, P. M., et al. The effector protein Avr2 of the xylem-colonizing fungus Fusarium oxysporum activates the tomato resistance protein I-2 intracellularly. The Plant Journal. 58 (6), 970-978 (2009).
  16. Czislowski, E., et al. Investigation of the diversity of effector genes in the banana pathogen, Fusarium oxysporum f. sp. cubense, reveals evidence of horizontal gene transfer. Molecular Plant Pathology. 19 (5), 1155-1171 (2018).
  17. Batson, A. M., Fokkens, L., Rep, M., du Toit, L. J. Putative effector genes distinguish two pathogenicity groups of Fusarium oxysporum f. sp. spinaciae. Molecular Plant-Microbe Interactions. 34 (2), 141-156 (2021).
  18. Keinath, A. P., DuBose, V. B., Katawczik, M. M., Wechter, W. P. Identifying races of Fusarium oxysporum f. sp. niveum in South Carolina recovered from watermelon seedlings, plants, and field soil. Plant Disease. 104 (9), 2481-2488 (2020).
  19. Gordon, T. R. Fusarium oxysporum and the Fusarium wilt syndrome. Annual Review of Phytopathology. 55, 23-39 (2017).
  20. Martyn, R., Netzer, D. Resistance to races 0, 1, and 2 of Fusarium wilt of watermelon in Citrullus sp. PI-296341-FR. HortScience. 26 (4), 429-432 (1991).
  21. Meru, G., McGregor, C. Genotyping by sequencing for SNP discovery and genetic mapping of resistance to race 1 of Fusarium oxysporum in watermelon. Scientia Horticulturae. 209, 31-40 (2016).
  22. Freeman, S., Rodriguez, R. A rapid inoculation technique for assessing pathogenicity of Fusarium oxysporum f. sp. niveum and F. o. melonis on cucurbits. Plant Disease. 77 (12), 1198-1201 (1993).
  23. Martyn, R. Fusarium oxysporum f. sp. niveum race 2: A highly aggressive race new to the United States. Plant Disease. 71 (3), 233-236 (1987).
  24. Lai, X., et al. Evaluating inoculation methods to infect sugar beet with Fusarium oxysporum f. Beat and F. secorum. Plant Disease. 104 (5), 1312-1317 (2020).
  25. Kirk, W., et al. Optimizing fungicide timing for the control of Rhizoctonia crown and root rot of sugar beet using soil temperature and plant growth stages. Plant Disease. 92 (7), 1091-1098 (2008).
  26. Ferguson, A., Jeffers, S. Detecting multiple species of Phytophthora in container mixes from ornamental crop nurseries. Plant Disease. 83 (12), 1129-1136 (1999).
  27. Fong, Y., Anuar, S., Lim, H., Tham, F., Sanderson, F. A modified filter paper technique for long-term preservation of some fungal cultures. Mycologist. 14 (3), 127-130 (2000).
  28. Rice, W. N. The hemocytometer method for detecting fungus spore load carried by wheat. Proceedings of the Association of Official Seed Analysts of North America. 31, 124-127 (1939).
  29. Kleczewski, N. M., Egel, D. S. A diagnostic guide for Fusarium wilt of watermelon. Plant Health Progress. 12 (1), 27 (2011).
  30. Dhingra, O. D., Sinclair, J. B. . Basic plant pathology methods. , (2017).
  31. Latin, R., Snell, S. Comparison of methods for inoculation of muskmelon with Fusarium oxysporum f. sp. melonis. Plant Disease. 70 (4), 297-300 (1986).
  32. Martyn, R. An iInitial survey of the United States for races of Fursarium oxysporum f. HortScience. 24 (4), 696-698 (1989).
  33. Zhou, X., Everts, K. Races and inoculum density of Fusarium oxysporum f. sp. niveum in commercial watermelon fields in Maryland and Delaware. Plant Disease. 87 (6), 692-698 (2003).
  34. Fulton, J. C., et al. Phylogenetic and phenotypic characterization of Fusarium oxysporum f. sp. niveum isolates from Florida-grown watermelon. PLoS One. 16 (3), 0248364 (2021).
  35. Zhou, X., Everts, K. Quantification of root and stem colonization of watermelon by Fusarium oxysporum f. sp. niveum and its use in evaluating resistance. Phytopathology. 94 (8), 832-841 (2004).
  36. Nutter, F. W., Esker, P. D., Netto, R. A. C. Disease assessment concepts and the advancements made in improving the accuracy and precision of plant disease data. European Journal of Plant Pathology. 115 (1), 95-103 (2006).
  37. Nutter, F., Gleason, M., Jenco, J., Christians, N. Assessing the accuracy, intra-rater repeatability, and inter-rater reliability of disease assessment systems. Phytopathology. 83 (8), 806-812 (1993).
  38. Chiang, K. -. S., Bock, C. H., Lee, I. -. H., El Jarroudi, M., Delfosse, P. Plant disease severity assessment-how rater bias, assessment method, and experimental design affect hypothesis testing and resource use efficiency. Phytopathology. 106 (12), 1451-1464 (2016).
  39. Nita, M., Ellis, M., Madden, L. Reliability and accuracy of visual estimation of Phomopsis leaf blight of strawberry. Phytopathology. 93 (8), 995-1005 (2003).
  40. Zhang, Z., Zhang, J., Wang, Y., Zheng, X. Molecular detection of Fusarium oxysporum f. sp. niveum and Mycosphaerella melonis in infected plant tissues and soil. FEMS Microbiology Letters. 249 (1), 39-47 (2005).
  41. Lin, Y. -. H., et al. Development of the molecular methods for rapid detection and differentiation of Fusarium oxysporum and F. oxysporum f. sp. niveum in Taiwan. New Biotechnology. 27 (4), 409-418 (2010).
  42. van Dam, P., de Sain, M., Ter Horst, A., vander Gragt, M., Rep, M. Use of comparative genomics-based markers for discrimination of host specificity in Fusarium oxysporum. Applied and Environmental Microbiology. 84 (1), 01868 (2018).
  43. Baayen, R. P., et al. Gene genealogies and AFLP analyses in the Fusarium oxysporum complex identify monophyletic and nonmonophyletic formae speciales causing wilt and rot disease. Phytopathology. 90 (8), 891-900 (2000).
  44. O’Donnell, K., Kistler, H. C., Cigelnik, E., Ploetz, R. C. Multiple evolutionary origins of the fungus causing Panama disease of banana: concordant evidence from nuclear and mitochondrial gene genealogies. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (5), 2044-2049 (1998).
  45. Laurence, M., Summerell, B., Liew, E. Fusarium oxysporum f. sp. canariensis: evidence for horizontal gene transfer of putative pathogenicity genes. Plant Pathology. 64 (5), 1068-1075 (2015).
  46. Hudson, O., et al. Marker development for differentiation of Fusarium oxysporum f. sp. Niveum race 3 from races 1 and 2. International Journal of Molecular Sciences. 22 (2), 822 (2021).

Tags

Keywords: Fusarium WiltRace-typingBioassayInoculationWatermelonPathogenDisease ManagementPlant HealthV8 Juice MediumPotato Dextrose AgarConidiaSpore QuantificationBleachPlantletsRoot Rinsing
check_url/it/63181?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Fulton, J. C., Cullen, M. A., Beckham, K., Sanchez, T., Xu, Z., Stern, P., Vallad, G., Meru, G., McGregor, C., Dufault, N. S. A Contrast of Three Inoculation Techniques used to Determine the Race of Unknown Fusarium oxysporum f.sp. niveum Isolates. J. Vis. Exp. (176), e63181, doi:10.3791/63181 (2021).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image