浸漬ビーズアッセイを用いたニワトリ胚発生時の細胞分化、形態形成、パターニングの解析
Summary
浸漬ビーズアッセイは、細胞分化および形態形成の調節を研究するために、任意の発生時点で試験試薬の標的送達を含む。任意の実験動物モデルに適用可能な、3つの異なるタイプの浸漬ビーズを調製し、これらをニワトリ胚の桁間に移植するための詳細なプロトコールが提示される。
Abstract
胚発生中に多数の遺伝子プログラムが活性化され、細胞分化を調整して、驚くほど多様な体細胞、組織、臓器を生み出します。これらの遺伝子プログラムの正確な活性化は、異なる閾値で細胞の運命を導く拡散性分子である形態原体によって調節される。遺伝的活性化が形態形成をどのように調整するかを理解するには、発生中に形態素によって引き起こされる局所相互作用の研究が必要である。胚の異なる領域に移植されたタンパク質または薬物に浸したビーズを使用することで、数字の確立および他の発生過程における特定の分子の役割を研究することができる。この実験技術は、細胞誘導、細胞運命、およびパターン形成の制御に関する情報を提供する。したがって、この浸漬ビーズアッセイは、他の胚モデルに適用可能な非常に強力で貴重な実験ツールです。
Introduction
胚発生中の遺伝子発現を制御する分子メカニズムのブレークスルーにより、細胞の運命がどのように決定されるかを理解することができました。異なる細胞系譜へのコミットメントは、細胞が転写因子の分子発現を開始すると起こる1。この発現パターンは、空間および時間において高度に協調的であり、それによって、細胞、組織、および器官の整形、位置決め、およびパターニングを指示する1、2、3、4、5。胚性誘導は、細胞の潜在能力を制限する階層を確立することによって細胞が特定の系統にコミットされるプロセスであり、Spemannオーガナイザー6,7で起こるような基本的なボディプランの生成も含まれる。この胚盤胞背唇は、宿主胚8、9において第2胚軸を誘導する。今日、移植および分子アプローチと組み合わせた他の古典的な実験の助けを借りて、異なる転写因子および成長因子がSpemannオーガナイザー10において胚誘導を指示するように機能することが知られている。したがって、実験的操作は、胚発生中の細胞分化、形態形成、およびパターニングプロセスを理解するための重要なツールである。
興味深いことに、組織移植が困難な胚系、またはインデューサーがすでによく知られている場合、担体は、細胞分化、形態形成、さらにはパターニングを調節する分子(例えば、タンパク質、化学物質、毒素など)を送達するために使用される。そのような担体システムの1つは、任意の発生時点で任意の実験モデル生物に特定の分子に浸したビーズを移植して、前記試薬の効果を決定するか、または前記モデルの分化を指示することを含む。例えば、レチノイン酸(RA)を浸したビーズを鶏の翅肢の芽に移植することによって、Cheryl Tickle et al. (1985)は、RAが偏光活性ゾーン(ZPA)における音波ハリネズミの発現を誘導することを実証した11,12。同じ実験戦略を用いて、RAが、数字発生中の四肢芽および他の胚性四肢領域におけるソマイトおよび細胞死の非対称性を制御することを発見した13、14、15。他の因子、主にタンパク質(例えば、線維芽細胞増殖因子[FGF]、形質転換増殖因子ベータ[TGF−ß])は、初期胚の脇腹およびデジタル間領域における新しい桁の四肢を誘導するために用いられており、それぞれ16、17、18、19、20、21.これらの実験は、分子に曝露された組織または細胞群のコミットメントまたは能力の段階を決定するためのこの技術の力および有用性を証明している。
このプロトコルでは、数字形成の段階でのひよこ四肢が実験モデルとなり、浸したビーズを調製および移植する方法を段階的に提示した。しかしながら、この実験ツールは、この用途に限定されるものではなく、誘導、分化、細胞死、およびパターニングを研究するために、 インビトロ および インビボで 任意の実験動物モデルおよび任意の時点において利用することができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコールで詳述されている実験ツールの主な利点は、所与の実験分子に浸されたビーズへの曝露の時間と位置を制御できることである。正しい位置決めと正確な発生タイミングを組み合わせることで、細胞分化過程を研究する大きな可能性を秘めています。これらの実験を未分化組織で行うことで、細胞系譜における最初の重要な事象を調査することができます。例えば、TGFß浸漬?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、JC-Mに授与されたメキシコ国立自治大学(DGAPA)と、JC-Mに授与されたConsejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) [助成金番号1887 CONACyT-Fronteras de la Ciencia]によって支援されました。JC M-Lは、Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología(CONACyT-Fronteras de la Ciencia-1887)からポスドクフェローシップを受けました。著者らはリックの助けに感謝している。Instituto de Investigaciones Biomédicas, UNAMのLucia Britoは、この原稿の準備参考文献に記載しています。
Materials
| Affi-Gel Blue Gel beads | Bio-Rad | 153-7302 | |
| AG1-X2 beads | Bio-Rad | 1400123 | |
| Egg incubator | Incumatic de Mexico | Incumatic 1000 | |
| Fine surgical forceps | Fine Science Tools | 9115-10 | |
| Heparine Sepharose beads | Abcam | ab193268 | |
| Petri dish | Nest | 705001 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi DV4 | |
| Tape | NA | NA | |
| Tungsten needle | GoodFellow | E74-15096/01 |
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