Soaked-Bead Assay를 사용한 닭 배아 발생 동안의 세포 분화, Morphogenesis, 및 패터닝 분석
Summary
침지된 비드 분석은 세포 분화 및 형태형성의 조절을 연구하기 위해 임의의 발달 시점에서 시험 시약의 표적화된 전달을 포함한다. 세 가지 다른 유형의 침지 된 구슬을 준비하고 닭 배아의 교차 숫자에 이식하기위한 모든 실험 동물 모델에 적용 가능한 상세한 프로토콜이 제시됩니다.
Abstract
배아 발달 중에 다수의 유전 프로그램이 활성화되어 세포 분화를 조율하여 체세포, 조직 및 장기의 놀라운 다양성을 생성합니다. 이러한 유전 프로그램의 정확한 활성화는 다른 역치에서 세포 운명을 지시하는 모르포겐, 확산성 분자에 의해 조절됩니다. 유전자 활성화가 형태 형성을 어떻게 조정하는지 이해하려면 개발 중에 모르포겐에 의해 유발 된 지역 상호 작용에 대한 연구가 필요합니다. 배아의 뚜렷한 영역에 이식 된 단백질 또는 약물에 담근 구슬을 사용하면 숫자 및 기타 발달 과정의 확립에서 특정 분자의 역할을 연구 할 수 있습니다. 이 실험 기술은 세포 유도, 세포 운명 및 패턴 형성의 제어에 대한 정보를 제공합니다. 따라서,이 흠뻑 젖은 비드 분석은 다른 배아 모델에 적용 할 수있는 매우 강력하고 가치있는 실험 도구입니다.
Introduction
배아 발달 동안 유전자 발현을 조절하는 분자 메커니즘의 돌파구는 우리가 세포 운명이 어떻게 결정되는지 이해할 수있게 해주었습니다. 상이한 세포 계보에 대한 헌신은 일단 세포가 전사 인자1의 분자 발현을 시작하면, 발생한다. 이러한 발현 패턴은 공간과 시간에서 고도로 조정되고, 따라서 세포, 조직 및 기관 1,2,3,4,5의 형성, 포지셔닝 및 패터닝을 지시한다. 배아 유도는 세포의 잠재력을 제한하는 계층 구조를 확립함으로써 세포가 특정 혈통에 전념하는 과정이며, 이는 심지어 Spemann 주최자 6,7에서 발생하는 기본 신체 계획의 생성을 포함합니다. 배반포어 등쪽 입술은 숙주 배아 8,9에서 두 번째 배아 축을 유도한다. 오늘날, 그래프팅 및 분자 접근법과 결합된 다른 고전적 실험의 도움으로, 상이한 전사 인자 및 성장 인자가 Spemann 조직자10에서 배아 유도를 지시하는 기능을 하는 것으로 알려져 있다. 따라서 실험 조작은 배아 발생 동안 세포 분화, 형태 형성 및 패터닝 과정을 이해하는 데 중요한 도구입니다.
흥미롭게도, 조직 이식이 어렵거나 유도제가 이미 잘 알려진 배아 시스템에서, 운반체는 세포 분화, 형태형성 및 심지어 패터닝을 조절하기 위해 분자 (예를 들어, 단백질, 화학물질, 독소 등)를 전달하는데 사용된다. 하나의 그러한 운반체 시스템은 상기 시약의 효과를 결정하거나 상기 모델의 분화를 지시하기 위해 임의의 발달 시점에서 임의의 실험 모델 유기체에 특정 분자에 담근 비드를 이식하는 것을 포함한다. 예를 들어, 닭 날개 사지 새싹에 레티노산 (RA)-담근 비드를 이식함으로써, Cheryl Tickle et al. (1985)는 RA가 편광 활성 (ZPA) 11,12의 영역에서 음파 고슴도치의 발현을 유도한다는 것을 입증했다. 동일한 실험 전략이 RA가 디지트 발달 동안 사지 새싹 및 다른 배아 사지 영역 13,14,15에서 소마이트 및 세포 사멸의 비대칭성을 조절한다는 것을 발견하기 위해 사용되었다. 다른 인자, 주로 단백질 (예를 들어, 섬유아세포 성장 인자 [FGF], 형질전환 성장 인자-베타 [TGF-ß])은 초기 배아의 옆구리에서 사지를 유도하고 인터디지털 영역에서 새로운 자릿수를 유도하는데 사용되어 왔으며, 각각16,17,18,19,20,21 . 이들 실험은 분자에 노출된 조직 또는 세포 그룹의 헌신 또는 능력의 단계를 결정하기 위한 이 기술의 힘과 유용성을 입증한다.
이 프로토콜에서, 자리 형성의 단계에서 병아리 사지는 침지된 비드를 제조하고 이식하는 방법을 단계적으로 제시하는 실험 모델로서 작용하였다. 그러나, 이러한 실험 도구는 본 출원에 한정되지 않지만, 유도, 분화, 세포 사멸 및 패터닝을 연구하기 위해 임의의 실험 동물 모델 및 시험관 내 및 생체내 임의의 시점들에서 이용될 수 있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜에 자세히 설명된 실험 도구의 주요 장점은 주어진 실험 분자에 담근 비드에 대한 노출의 시간 및 위치를 제어할 수 있다는 것입니다. 정확한 포지셔닝과 정확한 발달 타이밍을 결합하면 세포 분화 과정을 연구 할 수있는 엄청난 가능성을 제공합니다. 미분화 조직에서 이러한 실험을 수행하면 세포 계보에서 첫 번째 중요한 사건을 조사 할 수 있습니다. 예를 들어, TGFß-담근 비드를 배?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 Dirección General de Asuntos del Personal Académico (DGAPA)-Universidad Nacional Autónoma de México [보조금 번호 IN211117 및 IN213314] 및 Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) [보조금 번호 1887 CONACyT-Fronteras de la Ciencia]가 JC-M에 수여했습니다. JC M-L은 Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT-Fronteras de la Ciencia-1887)로부터 박사후 펠로우십을 받았다. 저자는 Lic의 도움을 주셔서 감사합니다. Instituto de Investigaciones Biomédicas, UNAM의 Lucia Brito는이 원고의 준비 참조.
Materials
| Affi-Gel Blue Gel beads | Bio-Rad | 153-7302 | |
| AG1-X2 beads | Bio-Rad | 1400123 | |
| Egg incubator | Incumatic de Mexico | Incumatic 1000 | |
| Fine surgical forceps | Fine Science Tools | 9115-10 | |
| Heparine Sepharose beads | Abcam | ab193268 | |
| Petri dish | Nest | 705001 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi DV4 | |
| Tape | NA | NA | |
| Tungsten needle | GoodFellow | E74-15096/01 |
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