Den gjennomvåte perleanalysen innebærer målrettet levering av testreagens på ethvert utviklingsmessig tidspunkt for å studere reguleringen av celledifferensiering og morfogenese. En detaljert protokoll, som gjelder for enhver eksperimentell dyremodell, for å forberede tre forskjellige typer gjennomvåt perler og implantere disse i mellombarn av et kyllingembryo, presenteres.
En rekke genetiske programmer aktiveres under embryonal utvikling som orkestrerer celledifferensiering for å generere et forbløffende mangfold av somatiske celler, vev og organer. Den nøyaktige aktiveringen av disse genetiske programmene er regulert av morfogene, diffusible molekyler som styrer celle skjebne på forskjellige terskler. Å forstå hvordan genetisk aktivering koordinerer morfogenese krever studiet av lokale interaksjoner utløst av morfogenes under utvikling. Bruken av perler gjennomvåt i proteiner eller legemidler implantert i forskjellige områder av embryoet gjør det mulig å studere rollen som spesifikke molekyler i etableringen av sifre og andre utviklingsprosesser. Denne eksperimentelle teknikken gir informasjon om kontroll av celleinduksjon, celle skjebne og mønsterdannelse. Dermed er denne gjennomvåte perleanalysen et ekstremt kraftig og verdifullt eksperimentelt verktøy som gjelder for andre embryonale modeller.
Gjennombrudd i molekylære mekanismer som kontrollerer genuttrykk under embryonal utvikling har gjort det mulig for oss å forstå hvordan celle skjebne bestemmes. Forpliktelse til forskjellige celleavledninger oppstår når cellene begynner molekylært uttrykk for transkripsjonsfaktorer1. Dette uttrykksmønsteret er svært koordinert i rom og tid og styrer dermed forming, posisjonering og mønster av celler, vev og organer 1,2,3,4,5. Embryonal induksjon er prosessen der celler er forpliktet til spesifikke avstamninger ved å etablere hierarkier som begrenser cellenes potensial, som til og med inkluderer genereringen av den grunnleggende kroppsplanen som følger medSpemann-arrangøren 6,7. Blastopore dorsal leppe induserer en annen embryonal akse i en vert embryo 8,9. I dag, ved hjelp av podning og andre klassiske eksperimenter kombinert med molekylære tilnærminger, er det kjent at forskjellige transkripsjonsfaktorer og vekstfaktorer fungerer for å lede embryonal induksjon iSpemann-arrangøren 10. Dermed er eksperimentell manipulasjon et viktig verktøy for å forstå celledifferensiering, morfogenese og mønsterprosesser under embryogenese.
Interessant, i embryonale systemer der vevstransplantasjon er vanskelig eller når induserne allerede er godt kjent, brukes bærere til å levere molekyler (f.eks. proteiner, kjemikalier, giftstoffer, etc.) for å regulere celledifferensiering, morfogenese og til og med mønster. Et slikt bærersystem innebærer implantering av perler gjennomvåt i et bestemt molekyl i enhver eksperimentell modellorganisme på et hvilket som helst utviklingstidspunkt for å bestemme effekten av nevnte reagens eller lede differensiering av nevnte modell. For eksempel, ved å implantere retinoinsyre (RA)-gjennomvåte perler i kyllingfløyens lemknopp, viste Cheryl Tickle et al. (1985) at RA induserer uttrykket av sonisk pinnsvin i sonen av polariserende aktivitet (ZPA) 11,12. Den samme eksperimentelle strategien ble brukt til å oppdage at RA kontrollerer asymmetrien av somitter og celledød i lemknoppen under sifferutvikling og i andre embryonale lemregioner 13,14,15. Andre faktorer, hovedsakelig proteiner (f.eks. fibroblast vekstfaktorer [FGF], transformering av vekstfaktor-beta [TGF-ß]) har blitt brukt til å indusere lemmer i tidlige embryoers flanker og nye sifre i den interdigitale regionen, henholdsvis 16,17,18,19,20,21 . Disse eksperimentene viser kraften og nytten av denne teknikken for å bestemme scenen for engasjement eller kompetanse av vev eller grupper av celler utsatt for molekylene.
I denne protokollen fungerte kyllinglemmen på scenen av sifferdannelse som eksperimentell modell for å presentere trinnvis hvordan man forbereder og implanterer de gjennomvåte perlene. Dette eksperimentelle verktøyet er imidlertid ikke begrenset til denne applikasjonen, men kan utnyttes i enhver eksperimentell dyremodell og ethvert tidspunkt in vitro og in vivo for å studere induksjon, differensiering, celledød og mønster.
Den største fordelen med det eksperimentelle verktøyet som er beskrevet i denne protokollen, er å kunne kontrollere tiden og plasseringen av eksponeringen for perler gjennomvåt i et gitt eksperimentelt molekyl. Å kombinere riktig posisjonering med presis utviklingstid gir enorme muligheter til å studere celledifferensieringsprosesser. Å utføre disse eksperimentene i undifferentiated vev gjør det mulig å undersøke de første viktige hendelsene i cellulær avstamning. For eksempel, å plassere en TGFß-gjennomv?…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av Dirección General de Asuntos del Personal Académico (DGAPA)-Universidad Nacional Autónoma de México [tilskuddsnumre IN211117 og IN213 og Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) [tilskuddsnummer 1887 CONACyT-Fronteras de la Ciencia] tildelt JC-M. JC M-L fikk postdoktorstipend fra Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT-Fronteras de la Ciencia-1887). Forfatterne setter pris på hjelp fra Lic. Lucia Brito fra Instituto de Investigaciones Biomédicas, UNAM i forberedelsene til dette manuskriptet.
Affi-Gel Blue Gel beads | Bio-Rad | 153-7302 | |
AG1-X2 beads | Bio-Rad | 1400123 | |
Egg incubator | Incumatic de Mexico | Incumatic 1000 | |
Fine surgical forceps | Fine Science Tools | 9115-10 | |
Heparine Sepharose beads | Abcam | ab193268 | |
Petri dish | Nest | 705001 | |
Stereomicroscope | Zeiss | Stemi DV4 | |
Tape | NA | NA | |
Tungsten needle | GoodFellow | E74-15096/01 |