إعداد وتربية الحشرات المحورية مع الشتلات المستزرعة في الأنسجة لدراسات تفاعل الميكروبات بين الأمعاء المضيفة لخنفساء الأوراق
Summary
للحصول على حشرة محورية ، يتم تعقيم سطح بيضتها ، ويتم تربية اليرقة المفرخة لاحقا باستخدام أوراق محورية. توفر هذه الطريقة طريقة فعالة لإعداد الحشرات المحورية دون إعطاء المضادات الحيوية أو تطوير نظام غذائي اصطناعي ، والذي يمكن تطبيقه أيضا على الحشرات الأخرى التي تأكل الأوراق.
Abstract
يتم استعمار أمعاء الحشرات بواسطة بكتيريا متنوعة يمكن أن تؤثر بشكل عميق على السمات الفسيولوجية للمضيف. يعد إدخال سلالة بكتيرية معينة في حشرة محورية طريقة قوية للتحقق من الوظيفة الميكروبية للأمعاء وتوضيح الآليات الكامنة وراء تفاعلات ميكروب الأمعاء مع المضيف. إدارة المضادات الحيوية أو تعقيم أسطح البيض هما طريقتان شائعتا الاستخدام لإزالة بكتيريا الأمعاء من الحشرات. ومع ذلك ، بالإضافة إلى الآثار الضارة المحتملة للمضادات الحيوية على الحشرات ، أشارت الدراسات السابقة إلى أن تغذية المضادات الحيوية لا يمكن أن تقضي على بكتيريا الأمعاء. وبالتالي ، يتم استخدام الأنظمة الغذائية الاصطناعية الخالية من الجراثيم بشكل عام للحفاظ على الحشرات المحورية ، وهي عملية شاقة وكثيفة العمالة لا يمكن أن تشبه تماما المكونات الغذائية في الأغذية الطبيعية. الموصوف هنا هو بروتوكول فعال وبسيط لإعداد والحفاظ على اليرقات المحورية لخنفساء الأوراق (Plagiodera versicolora). على وجه التحديد ، تم تعقيم أسطح بيض الخنفساء ، وبعد ذلك تم استخدام أوراق الحور الخالية من الجراثيم لتربية اليرقات المحورية. تم تأكيد الحالة المحورية للحشرات بشكل أكبر من خلال الفحوصات المعتمدة على الثقافة والمستقلة عن الثقافة. بشكل جماعي ، من خلال الجمع بين تطهير البيض والزراعة الخالية من الجراثيم ، تم تطوير طريقة فعالة ومريحة للحصول على P. versicolora axenic ، مما يوفر أداة قابلة للتحويل بسهولة للحشرات الأخرى التي تأكل الأوراق.
Introduction
على غرار الثدييات ، فإن الجهاز الهضمي للحشرات هو تجويف لهضم الطعام وامتصاصه. معظم الحشرات تؤوي بكتيريا مترادفة متنوعة تزدهر في أحشائها وتعيش على التغذية التي توفرها المضيفات1. المجتمع المتزامن المعوي له تأثير عميق على العمليات الفسيولوجية المتعددة في الحشرات ، بما في ذلك هضم الطعام وإزالة السموم2،3،4 ، التغذية والتنمية5،6،7 ، الدفاع ضد مسببات الأمراض والطفيليات8،9،10،11 ، الاتصالات الكيميائية12،13 والسلوكيات 14 ، 15. ومن المثير للاهتمام أن بعض ميكروبات الأمعاء يمكن أن تكون مسببة للأمراض بشكل اختياري أو يتم التلاعب بها عن طريق غزو مسببات الأمراض لتفاقم العدوى ، مما يشير إلى أن بكتيريا الأمعاء يمكن أن تكون ضارة في بعض الحالات16،17،18. يمكن أن تعمل بكتيريا الأمعاء أيضا كمورد ميكروبي للتطبيقات التقنية الحيوية وإدارة الآفات. على سبيل المثال ، تم استخدام البكتيريا التي تهضم الليجنوسليلوز من الحشرات النباتية و xylophagous لهضم الخلايا النباتية لتطوير الوقود الحيوي19. إن تشتت تكافل الأمعاء الهندسي الذي يعبر عن جزيئات نشطة بيولوجيا هو تكتيك جديد وواعد لإدارة الآفات الزراعية والحرجية والبعوض الذي ينقل الأمراض المعدية19،20،21 ، والتي يمكن استخدامها أيضا لتحسين لياقة الحشرات المفيدة 22. وبالتالي فإن توضيح كيفية تصرف بكتيريا الأمعاء في الجسم الحي يعتبر أولوية للاستفادة الكاملة من وظيفتها واستغلالها بشكل أكبر في التطبيقات المختلفة.
يمكن للحيوانات أن تؤوي 1 إلى >1000 نوع من الميكروبات التكافلية في الأمعاء1. ونتيجة لذلك ، من الصعب التحقق بدقة من كيفية أداء الأصناف البكتيرية الفردية أو تجميعها داخل ، وما إذا كان المضيف أو شركاؤه الميكروبيون يقودون وظيفة محددة. لذلك ، فإن إعداد اليرقات المحورية للحصول على الحشرات الجنوتوبيوتيكية عن طريق الاستعمار الأحادي أو متعدد الأنواع ضروري للتحقيق في الوظيفة البكتيرية والتفاعل مع الحشرات23. في الوقت الحاضر ، تعد إدارة كوكتيلات المضادات الحيوية وتعقيم سطح بيض الحشرات من الطرق الشائعة لإزالة بكتيريا الأمعاء14،24،25،26. ومع ذلك ، لا يمكن للأنظمة الغذائية بالمضادات الحيوية القضاء على بكتيريا الأمعاء تماما ولها تأثير سلبي على فسيولوجيا الحشرات المضيفة27,28. وبالتالي ، فإن استخدام الحشرات المعالجة بالمضادات الحيوية قد يحجب القدرات الحقيقية لبعض بكتيريا الأمعاء. لحسن الحظ ، يمكن أن ينفي التعقيم السطحي للبيض هذه المشكلة23,29 ، والتي ليس لها أي آثار أو لا تذكر على الحشرات التجريبية. علاوة على ذلك ، لا يمكن أن تشبه الأنظمة الغذائية الاصطناعية تماما طعام الحشرات الطبيعي ، وتطوير نظام غذائي اصطناعي هو عملية مكلفة ومستهلكة للعمالة30,31.
خنفساء أوراق الصفصاف ، Plagiodera versicolora (Laicharting) (Coleoptera: Chrysomelidae) ، هي آفة آفة آكلة أوراق الشجر على نطاق واسع تتغذى بشكل رئيسي على أشجار الساليكاسيوس ، مثل الصفصاف (Salix) والحور (Populus L.) 32,33. هنا ، تم استخدام خنفساء أوراق الصفصاف كحشرة تمثيلية آكلة للأوراق لتطوير بروتوكول لإعداد وتربية حشرة خالية من الجراثيم. لقد استغلنا زراعة الأنسجة النباتية للحصول على أوراق الحور الخالية من الجراثيم إلى اليرقات المحورية P. versicolora الخلفية من البيض المعقم. تم التحقق من الحالة المحورية ليرقات P. versicolora من خلال الفحوصات المعتمدة على الثقافة والمستقلة عن الثقافة. يمكن لهذا البروتوكول الحفاظ على الحشرات المحورية التي تحاكي الحالة البرية بشكل أفضل من تربية الحشرات بنظام غذائي اصطناعي. الأهم من ذلك ، أن هذه الطريقة مريحة بتكلفة منخفضة للغاية ، مما يزيد من جدوى الحصول على الحشرات المحورية لدراسات التفاعل بين الميكروبات والأمعاء الحشرية المستقبلية ، خاصة بالنسبة للحشرات غير النموذجية التي لا تحتوي على أنظمة غذائية اصطناعية متطورة.
Protocol
Representative Results
Discussion
يعد تحضير اليرقات الخالية من الجراثيم والحصول على يرقات جنوتوبيوتيك عن طريق إعادة إدخال سلالات بكتيرية محددة من الطرق القوية لتوضيح الآليات الكامنة وراء التفاعلات بين الميكروبات المضيفة. تحصل اليرقات التي تم فقسها حديثا على ميكروبات الأمعاء بطريقتين رئيسيتين: الانتقال الرأسي من الأم إ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (31971663) وبرنامج رعاية العلماء النخبة الشباب من قبل CAST (2020QNRC001).
Materials
| 0.22 µm syringe filters | Millipore | SLGP033RB | |
| 1 mg/mL NAA stock solution | a. Prepare 0.1 M NaOH solution (dissolve 0.8 g NaOH in 200 mL of distilled water). b. Add 0.2 g NAA in a 250 mL beaker, add little 0.1 M NaOH solution until NAA dissolved, and adjust the final volume to 200 mL with distilled water. c. Filter the solution to remove bacteria with a 0.22 µm syringe filter and a 50 mL sterile syringe, subpackage the solution in 1.5 mL centrifuge tubes and restore at -20 °C. |
||
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Sangon Biotech | F600620 | |
| 10x PBS stock solution | Biosharp Life Sciences | BL302A | |
| 2 M KOH solution | Dissolve 22.44 g KOH (molecular weight: 56.1) in 200 mL of distilled water and autoclave it for 20 min at 121 °C. | ||
| 250 mL and 2,000 mL beakers | Shubo | sb16455 | |
| 50 mL sterile syringes | Jinta | JT0125789 | |
| 500 mL measuring cylinder | Shubo | sb1601 | |
| 50x TAE stock solution | a. Dissolve 242 g Tris and 18.612 g EDTA in 700 mL of distilled water. b. Adjust pH to 7.8 with about 57.1 mL of acetic acid. c. Adjust the final volume to 1,000 mL. d. The stock solution was diluted to 1x TAE buffer when used. |
||
| 75% ethanol | Xingheda trade | ||
| α-naphthalene acetic acid (NAA) | Solarbio Life Sciences | 86-87-3 | |
| Absorbing paper | 22.3 cm x 15.3 cm x 9 cm | ||
| Acetic acid | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
| Agar | Coolaber | 9002-18-0 | |
| Agarose | Biowest | 111860 | |
| Autoclave | Panasonic | MLS-3781L-PC | |
| Bead-beating homogenizer | Jing Xin | XM-GTL64 | |
| DNA extraction kit | MP Biomedicals | 116560200 | |
| EDTA | Saiguo Biotech | 1340 | |
| Filter paper | Jiaojie | 70 mm diameter | |
| Gel electrophoresis unit | Bio-rad | 164-5052 | |
| Gel Signal Green nucleic acid dye | TsingKe | TSJ003 | |
| Germ-free poplar seedlings | Shan Xin poplar from Ludong University in Shandong Province | ||
| Golden Star Super PCR Master Mix (1.1×) | TsingKe | TSE101 | |
| Growth chamber | Ruihua | HP400GS-C | |
| LB agar medium | a. Dissolve 5 g tryptone, 5 g NaCl, 2.5 g yeast extract in 300 mL of distilled water. b. Adjust the final volume to 500 mL, transfer the solution to a 1,000 mL conical flask, and add 7.5 g agar. c. Autoclave the medium for 20 min at 121 °C. |
||
| Mini centrifuge | DRAGONLAB | D1008 | |
| MS basic medium | Coolaber | PM1121-50L | M0245 |
| MS solid medium for germ-free poplar seedling culture | a. Dissolve 4.43 g MS basic medium powder and 30 g sucrose in 800 mL of distilled water. b. Adjust the pH to about 5.8 with 2 M KOH by a pH meter. c. Adjust the final volume to 1,000 mL, separate into two parts, transfer into two 1,000 mL conical flasks, and add 2.6 g agar per 500 mL. d. Autoclave for 20 min at 121 °C. |
||
| NanoDrop 1000 spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| Paintbrush | 1 cm width, used to collect the eggs | ||
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| PCR Thermal Cyclers | Eppendorf | 6331000076 | |
| Petri dishes | Supin | 90 mm diameter | |
| pH meter | METTLER TOLEDO | FE20 | |
| Pipettes 0.2-2 µL | Gilson | ECS000699 | |
| Pipettes 100-1,000 µL | Eppendorf | 3120000267 | |
| Pipettes 20-200 µL | Eppendorf | 3120000259 | |
| Pipettes 2-20 µL | Eppendorf | 3120000232 | |
| Plant tissue culture container | Chembase | ZP21 | 240 mL |
| Plastic box | 2.35 L | ||
| Potassium hydroxide (KOH) | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
| Primers for amplifying the bacterial 16S rRNA gene | Sangon Biotech | 27-F: 5’-ACGGATACCTTGTTACGAC-3’, 1492R: 5’-ACGGATACCTTGTTACGAC-3’ | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
| Steel balls | 0.25 mm | used to grind tissues | |
| Stereomicroscope | OLYMPUS | SZ61 | |
| Sucrose | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
| Trans2K plus II DNA marker | Transgene Biotech | BM121-01 | |
| Tris base | Biosharp Life Sciences | 1115 | |
| Tryptone | Thermo Fisher Scientific | LP0037 | |
| UV transilluminator | Monad Biotech | QuickGel 6100 | |
| Vortexer | Scilogex | MX-S | |
| Willow branches | Sha Lake Park, Wuhan, China | ||
| Willow leaf beetle | Huazhong Agricultural University, Wuhan, China | ||
| Yeast extract | Thermo Fisher Scientific | LP0021 |
Riferimenti
- Moran, N. A., Ochman, H., Hammer, T. J. Evolutionary and ecological consequences of gut microbial communities. Annual Review of Ecology, Evolution, and Systematics. 50 (1), 451-475 (2019).
- Warnecke, F., et al. Metagenomic and functional analysis of hindgut microbiota of a wood-feeding higher termite. Nature. 450 (7169), 560-565 (2007).
- Tokuda, G., et al. Fiber-associated spirochetes are major agents of hemicellulose degradation in the hindgut of wood-feeding higher termites. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (51), 11996-12004 (2018).
- Wang, G. H., et al. Changes in microbiome confer multigenerational host resistance after sub-toxic pesticide exposure. Cell Host & Microbe. 27 (2), 213-224 (2020).
- Shin, S. C., et al. Drosophila microbiome modulates host developmental and metabolic homeostasis via insulin signaling. Science. 334 (6056), 670-674 (2011).
- Storelli, G., et al. Lactobacillus plantarum promotes Drosophila systemic growth by modulating hormonal signals through TOR-dependent nutrient sensing. Cell Metabolism. 14 (3), 403-414 (2011).
- Salem, H., et al. Vitamin supplementation by gut symbionts ensures metabolic homeostasis in an insect host. Proceedings. Biological Sciences. 281 (1796), 20141838 (2014).
- Koch, H., Schmid-Hempel, P. Socially transmitted gut microbiota protect bumble bees against an intestinal parasite. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (48), 19288-19292 (2011).
- Cirimotich, C. M., et al. Natural microbe-mediated refractoriness to Plasmodium infection in Anopheles gambiae. Science. 332 (6031), 855-858 (2011).
- Kaltenpoth, M., Gottler, W., Herzner, G., Strohm, E. Symbiotic bacteria protect wasp larvae from fungal infestation. Current Biology. 15 (5), 475-479 (2005).
- Yuan, C., Xing, L., Wang, M., Hu, Z., Zou, Z. Microbiota modulates gut immunity and promotes baculovirus infection in Helicoverpa armigera. Insect Science. , (2021).
- Dillon, R. J., Vennard, C. T., Charnley, A. K. Pheromones – Exploitation of gut bacteria in the locust. Nature. 403 (6772), 851 (2000).
- Xu, L. T., Lou, Q. Z., Cheng, C. H., Lu, M., Sun, J. H. Gut-associated bacteria of Dendroctonus valens and their involvement in verbenone production. Microbial Ecology. 70 (4), 1012-1023 (2015).
- Schretter, C. E., et al. A gut microbial factor modulates locomotor behaviour in Drosophila. Nature. 563 (7731), 402-406 (2018).
- Jia, Y., et al. Gut microbiome modulates Drosophila aggression through octopamine signaling. Nature Communications. 12 (1), 2698 (2021).
- Ma, M., et al. Metabolic and immunological effects of gut microbiota in leaf beetles at the local and systemic levels. Integrative Zoology. 16 (3), 313-323 (2021).
- Xu, L., et al. Synergistic action of the gut microbiota in environmental RNA interference in a leaf beetle. Microbiome. 9 (1), 98 (2021).
- Xu, L., et al. Gut microbiota in an invasive bark beetle infected by a pathogenic fungus accelerates beetle mortality. Journal of Pest Science. 92, 343-351 (2019).
- Berasategui, A., Shukla, S., Salem, H., Kaltenpoth, M. Potential applications of insect symbionts in biotechnology. Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (4), 1567-1577 (2016).
- Tikhe, C. V., Martin, T. M., Howells, A., Delatte, J., Husseneder, C. Assessment of genetically engineered Trabulsiella odontotermitis as a ‘Trojan Horse’ for paratransgenesis in termites. BMC Microbiology. 16 (1), 202 (2016).
- Wang, S., et al. Fighting malaria with engineered symbiotic bacteria from vector mosquitoes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (31), 12734-12739 (2012).
- Leonard, S. P., et al. Engineered symbionts activate honey bee immunity and limit pathogens. Science. 367 (6477), 573-576 (2020).
- Kietz, C., Pollari, V., Meinander, A. Generating germ-free Drosophila to study gut-microbe interactions: protocol to rear Drosophila under axenic conditions. Current Protocols in Toxicology. 77 (1), 52 (2018).
- Brummel, T., Ching, A., Seroude, L., Simon, A. F., Benzer, S. Drosophila lifespan enhancement by exogenous bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (35), 12974-12979 (2004).
- Correa, M. A., Matusovsky, B., Brackney, D. E., Steven, B. Generation of axenic Aedes aegypti demonstrate live bacteria are not required for mosquito development. Nature Communications. 9 (1), 4464 (2018).
- Romoli, O., Schonbeck, J. C., Hapfelmeier, S., Gendrin, M. Production of germ-free mosquitoes via transient colonisation allows stage-specific investigation of host-microbiota interactions. Nature Communications. 12 (1), 942 (2021).
- Berasategui, A., et al. Gut microbiota of the pine weevil degrades conifer diterpenes and increases insect fitness. Molecular Ecology. 26 (15), 4099-4110 (2017).
- Lin, X. L., Kang, Z. W., Pan, Q. J., Liu, T. X. Evaluation of five antibiotics on larval gut bacterial diversity of Plutella xylostella (Lepidoptera: Plutellidae). Insect Science. 22 (5), 619-628 (2015).
- Muhammad, A., Habineza, P., Hou, Y., Shi, Z. Preparation of red palm weevil Rhynchophorus Ferrugineus (Olivier) (Coleoptera: Dryophthoridae) germ-free larvae for host-gut microbes interaction studies. Bio-protocol. 9 (24), 3456 (2019).
- Gelman, D. B., Bell, R. A., Liska, L. J., Hu, J. S. Artificial diets for rearing the Colorado potato beetle, Leptinotarsa decemlineata. Journal of Insect Science. 1, 7 (2001).
- Bengtson, D. A. A comprehensive program for the evaluation of artificial diets. Journal of the World Aquaculture Society. 24 (2), 285-293 (2007).
- Utsumi, S., Ando, Y., Ohgushi, T. Evolution of feeding preference in a leaf beetle: the importance of phenotypic plasticity of a host plant. Ecology Letters. 12 (9), 920-929 (2009).
- Ishihara, M., Ohgushi, T. Reproductive inactivity and prolonged developmental time induced by seasonal decline in host plant quality in the willow leaf beetle Plagiodera versicolora (Coleoptera: Chrysomelidae). Environmental Entomology. 35 (2), 524-530 (2006).
- Bright, M., Bulgheresi, S. A complex journey: transmission of microbial symbionts. Nature Reviews: Microbiology. 8 (3), 218-230 (2010).
- Hassan, B., Siddiqui, J. A., Xu, Y. Vertically transmitted gut bacteria and nutrition influence the immunity and fitness of Bactrocera dorsalis larvae. Frontiers in Microbiology. 11, 596352 (2020).
- Hosokawa, T., et al. Obligate bacterial mutualists evolving from environmental bacteria in natural insect populations. Nature Microbiology. 1, 15011 (2016).
- Habineza, P., et al. The promoting effect of gut microbiota on growth and development of red palm weevil, Rhynchophorus ferrugineus (Olivier) (Coleoptera: Dryophthoridae) by modulating its nutritional metabolism. Frontiers in Microbiology. 10, 1212 (2019).
- Meilan, R., Ma, C. Poplar (Populus spp.). Methods in Molecular Biology. 344, 143-151 (2006).
- Wani, Z. A., Ashraf, N., Mohiuddin, T., Riyaz-Ul-Hassan, S. Plant-endophyte symbiosis, an ecological perspective. Applied Microbiology and Biotechnology. 99 (7), 2955-2965 (2015).
- Grout, B. W. Meristem-tip culture. Methods in Molecular Biology. 6, 81-91 (1990).
