تصوير بؤري عالي الإنتاجية لمشمشات سبايك SARS-CoV-2 ذات النقاط الكمومية لتتبع الارتباط وكثرة الخلايا الداخلية في خلايا HEK293T
Summary
في هذا البروتوكول ، تمكن النقاط الكمومية المترافقة مع ارتفاع SARS-CoV-2 المؤتلف من الفحوصات القائمة على الخلايا من مراقبة ارتباط السنبلة إلى hACE2 في غشاء البلازما وكثرة الخلايا الداخلية اللاحقة للبروتينات المرتبطة في السيتوبلازم.
Abstract
وقد سهل تطوير تكنولوجيات جديدة للفحص المجهري الفلوري الخلوي طرق الفحص عالية الإنتاجية لاكتشاف الأدوية. النقاط الكمومية هي جسيمات نانوية فلورية ذات خصائص فيزيائية ضوئية ممتازة مشبعة بالتلألؤ الضوئي الساطع والمستقر بالإضافة إلى نطاقات الانبعاثات الضيقة. النقاط الكمومية كروية الشكل ، ومع التعديل المناسب لكيمياء السطح ، يمكن استخدامها لاقتران الجزيئات الحيوية للتطبيقات الخلوية. هذه الخصائص البصرية ، جنبا إلى جنب مع القدرة على تشغيلها مع الجزيئات الحيوية ، تجعلها أداة ممتازة للتحقيق في التفاعلات بين المستقبلات والروابط والاتجار الخلوي. هنا ، نقدم طريقة تستخدم النقاط الكمومية لتتبع الارتباط و endocytosis من بروتين سبايك SARS-CoV-2. يمكن استخدام هذا البروتوكول كدليل للتجريبيين الذين يتطلعون إلى استخدام النقاط الكمومية لدراسة تفاعلات البروتين والبروتين والاتجار في سياق علم وظائف الأعضاء الخلوية.
Introduction
يمكن الفحص المجهري الفلوري الباحثين من النظر في الأعمال الداخلية للخلية باستخدام أصباغ متخصصة1 وبروتينات فلورسنت مشفرة وراثيا2 وجسيمات نانوية فلورية في شكل نقاط كمومية (QDs)3. بالنسبة للوباء العالمي لفيروس كورونا المسبب للمتلازمة التنفسية الحادة الوخيمة لعام 2019 (SARS-CoV-2) ، استخدم الباحثون المجهر الفلوري لفهم كيفية تفاعل الفيروس مع الخلية في كل من غشاء البلازما والسيتوبلازم. على سبيل المثال ، تمكن الباحثون من اكتساب رؤى ثاقبة حول ارتباط بروتين SARS-CoV-2 Spike على سطح الفيريون بالإنزيم البشري المحول للأنجيوتنسين 2 (hACE2) على سطح الخلايا البشرية ، والاستيعاب اللاحق عن طريق الاندماج في غشاء البلازما ، وكثرة الخلايا الداخلية لمركب بروتين Spike:hACE24,5. كما تم اكتساب رؤى كبيرة حول خروج SARS-CoV-2 من الخلايا عبر الليزوسوم باستخدام التصوير الفلوري الخلوي، وهي ميزة فريدة من الفيروسات التاجية التي كان يعتقد سابقا أنها تحدث عبر الحويصلة التقليدية الناشئة من غولجي، كما هو الحال مع العديد من الفيروسات الأخرى6. تعد تقنية الفحص المجهري الفلوري الخلوي الدعامة الأساسية لجميع جوانب البحوث البيولوجية تقريبا ، وقد تقدمت بالضرورة في اتساعها ونطاق تطبيقاتها من التصوير فائق الدقة للحيوانات الكاملة إلى التصوير الآلي متعدد المعلمات عالي المحتوى لفحص الأدوية. هنا ، يتم تطبيق المجهر البؤري الآلي عالي المحتوى على دراسة دخول خلايا SARS-CoV-2 باستخدام QDs الفلورية المترافقة مع بروتين سبايك الفيروسي.
يسمح التحليل عالي المحتوى للصور التي تم إنشاؤها بواسطة منصات التصوير البيولوجي باستخراج أكبر للرؤى البيولوجية القيمة من المعلمات الفردية مثل كثافة البئر الكاملة ، والتي يمكن للمرء الحصول عليها باستخدام قارئ لوحة متعدد الوسائط 7. من خلال فصل الكائنات في مجال رؤية باستخدام خوارزميات التجزئة الآلية، يمكن تحليل كل كائن أو مجموعة من الكائنات بحثا عن معلمات مثل الكثافة والمساحة والملمس في كل قناة فلورية متاحة8. يعد الجمع بين العديد من القياسات في مجموعات بيانات متعددة المتغيرات نهجا مفيدا للتنميط المظهري. عندما يكون النمط الظاهري المطلوب معروفا ، مثل استيعاب QD في شكل puncta ، يمكن للمرء استخدام القياسات المتعلقة بالثقب مثل الحجم والعدد والشدة لتقييم فعالية العلاج.
يمكن لبرنامج تحليل التصوير عالي المحتوى المستند إلى السحابة استيعاب مجموعة كبيرة ومتنوعة من مخرجات بيانات الأجهزة ، بما في ذلك منصة التصوير عالية المحتوى. باستخدام خادم قائم على السحابة لتخزين الصور والتحليل عبر الإنترنت ، يمكن للمستخدم تحميل بياناته إما من أداة التصوير أو من محرك أقراص الشبكة حيث يتم تخزين البيانات. يتم إجراء جزء التحليل من البروتوكول داخل بيئة البرامج السحابية ، ويمكن تصدير البيانات في مجموعة متنوعة من تنسيقات الملفات لتصور البيانات النهائية.
يتكون فيروس SARS-CoV-2 من بروتينات غير هيكلية وهيكلية تساعد في تجميعه وتكراره. يحتوي ارتفاع SARS-CoV-2 على مجالين يطلق عليهما S1 و S2 ، حيث يحتوي S1 على مجال ربط المستقبلات المسؤول عن تفاعلات hACE2 في غشاء البلازما 9. كما وجد أن سبايك يتفاعل مع جزيئات أخرى في غشاء البلازما التي قد تعمل كمستقبلات مشتركة بالإضافة إلى hACE210,11. في جميع أنحاء تسلسل بروتين سبايك وخاصة في واجهة S1 / S2 ، هناك مواقع انقسام البروتياز التي تمكن من الاندماج في الغشاء بعد بروتياز سيرين عبر الغشاء 2 (TMPRSS2)12. تم إنتاج العديد من بروتينات SARS-CoV-2 Spike المؤتلفة من مجالات ربط المستقبلات الفردية ، إلى S1 و S2 و S1 مع S2 ، وآلات تشذيب السنبلة الكاملة من بائعين تجاريين متعددين لاستخدامها في الأنشطة البحثية13.
في هذا العمل ، تم تشغيل سطح QDs باستخدام أدوات تشذيب السنبلة المؤتلفة التي تحتوي على علامة الهيستيدين (QD-Spike). تحتوي QDs التي ينتجها قسم المواد النانوية البصرية في مختبر البحوث البحرية على نواة سيلينيد الكادميوم وقذيفة كبريتيد الزنك 14,15. يقوم الزنك الموجود على سطح QD بتنسيق بقايا الهيستيدين داخل البروتين المؤتلف لتشكيل QD وظيفي يشبه جسيم فيروس SARS-CoV-2 في الشكل والوظيفة. وقد سبق وصف توليد الجسيمات النانوية واقتران البروتين باستخدام مجال ربط المستقبلات المترافقة مع QD15. تصف هذه الطريقة مستحضرات زراعة الخلايا ، وعلاج QD ، والحصول على الصور ، وبروتوكول تحليل البيانات الذي يمكن أن يوجه الباحث في دراسة نشاط SARS-CoV-2 Spike في السياق الفسيولوجي للخلية البشرية.
Protocol
Representative Results
Discussion
توفر الطريقة الموضحة في هذه المقالة الخطوات اللازمة لتصوير QDs الوظيفية في الخلايا البشرية باستخدام المجهر البؤري عالي الإنتاجية. هذه الطريقة هي الأنسب للخلايا حيث يكون كثرة الخلايا الداخلية هو الطريق الرئيسي للدخول الفيروسي بدلا من نشاط TMPRSS2 والانصهار الغشائي ، لأنها تمكن من دراسة SARS-CoV-2…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا البحث جزئيا من قبل برنامج البحوث الداخلية التابع للمركز الوطني للنهوض بالعلوم الانتقالية ، المعاهد الوطنية للصحة. قدم مختبر البحوث البحرية التمويل من خلال معهد علوم النانو الداخلي التابع له. تم دعم إعداد الكاشف من خلال الصندوق الأساسي NRL COVID-19.
Materials
| 32% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714 | Used for fixing cells after quantum dot treatment, final concentration 3.2% Used for stabilizing QDs in Optimem I and preventing non-specific interactions, final concentration 0.1% |
| 7.5% Bovine Serum Albumin | Gibco | 15260-037 | Used as a cell viability dye for fluorescence cell counting |
| Acridine Orange / Propidium Iodide Stain | Logos Biosystems | F23001 | Microwell plates used for seeding cells and assaying QD-Spike |
| Black clear bottom 96 well coated plate coated with poly-D-lysine | Greiner | 655946 | Used to support cell culture, DMEM supplement |
| Characterized Fetal Bovine Serum | Cytiva/HyClone | SH30071.03 | Cloud-based high-content image analysis software; V2.9.1 |
| Columbus Analyzer | Perkin Elmer | NA | Used for labeling cell nuclei and cell bodies after fixation, deep red nuclear dye |
| DRAQ5 (5 mM) | ThermoFisher Scientific | 62252 | Basal media for HEK293T cell culture |
| Dulbecco's Minimal Essential Media, D-glucose (4.5g/L), L-glutamine, sodium pyruvate (110 mg/L), phenol red | Gibco | 11995-065 | Used for arranging data after export from Columbus; V2110 Microsoft 365 |
| Excel | Microsoft | NA | Used to continue selection of hACE2-GFP positive cells, DMEM supplement |
| G418 | InvivoGen | ant-gn-5 | Human embryonic kidney cell line stably expression human angiotensin converting enzyme 2 tagged with GFP |
| HEK293T hACE2-GFP | Codex Biosolutions | CB-97100-203 | Automated cell counter |
| Luna Automated Cell Counter | Logos Biosystems | NA | Used for fluorescence cell counting |
| Luna Cell Counting Slides | Logos Biosystems | L12001 | High-content imaging platform |
| Opera Phenix | Perkin Elmer | NA | Imaging media, used for incubating cells with quantum dots |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 11058-021 | Phosphate-buffered saline without calcium or magnesium used for washing cells during passaging and assaying |
| PBS -/- | Gibco | 10010-023 | Used to prevent bacterial contamination of cell culture, DMEM supplement |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Used for graphing, data visualization, and statistical analysis;V9.1.0 |
| Prism | GraphPad | NA | Used for assaying SARS-Cov-2 Spike binding to hACE2 and monitoring Spike endocytosis |
| Quantum Dot 608 nm-Spike (QD608-Spike) | custom made by Naval Research Laboratory | Used for inhibition of SARS-Cov-2 Spike binding to hACE2 | |
| SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab | Sino Biological | 40592-MM57 | Used to dissociate cells from flask during passaging |
| TrypLE Express | Gibco | 12605-010 |
Riferimenti
- Chazotte, B. Labeling Lysosomes in Live Cells with LysoTracker. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5571 (2011).
- Mehta, S., Zhang, J. Biochemical activity architectures visualized-using genetically encoded fluorescent biosensors to map the spatial boundaries of signaling compartments. Accounts of Chemical Research. 54 (10), 2409-2420 (2021).
- Barroso, M. M. Quantum dots in cell biology. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 59 (3), 237-251 (2011).
- Cuervo, N. Z., Grandvaux, N. ACE2: Evidence of role as entry receptor for SARS-CoV-2 and implications in comorbidities. eLife. 9, 61390 (2020).
- Shang, J., et al. Cell entry mechanisms of SARS-CoV-2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (21), 11727-11734 (2020).
- Ghosh, S., et al. β-Coronaviruses use lysosomes for egress instead of the biosynthetic secretory pathway. Cell. 183 (6), 1520-1535 (2020).
- Buchser, W., et al., Markossian, S., et al. Assay development guidelines for image-based high content screening, high content analysis and high content imaging. Assay Guidance Manual. , (2012).
- Chandrasekaran, S. N., Ceulemans, H., Boyd, J. D., Carpenter, A. E. Image-based profiling for drug discovery: due for a machine-learning upgrade. Nature Reviews. Drug Discovery. 20 (2), 145-159 (2021).
- Huang, Y., Yang, C., Xu, X. F., Xu, W., Liu, S. W. Structural and functional properties of SARS-CoV-2 spike protein: potential antivirus drug development for COVID-19. Acta Pharmacologica Sinica. 41 (9), 1141-1149 (2020).
- Gao, C., et al. SARS-CoV-2 spike protein interacts with multiple innate immune receptors. bioRxiv: the preprint server for biology. , 227462 (2020).
- Zhang, Q., et al. Heparan sulfate assists SARS-CoV-2 in cell entry and can be targeted by approved drugs in vitro. Cell Discovery. 6 (1), 80 (2020).
- Hoffmann, M., et al. SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and Is blocked by a clinically proven protease inhibitor. Cell. 181 (2), 271-280 (2020).
- Cai, Y., et al. Distinct conformational states of SARS-CoV-2 spike protein. Science. 369 (6511), 1586-1592 (2020).
- Oh, E., et al. Meta-analysis of cellular toxicity for cadmium-containing quantum dots. Nature Nanotechnology. 11 (5), 479-486 (2016).
- Gorshkov, K., et al. Quantum dot-conjugated SARS-CoV-2 spike pseudo-virions enable tracking of angiotensin Converting enzyme 2 binding and endocytosis. ACS Nano. 14 (9), 12234-12247 (2020).
- Narayanan, S. S., Pal, S. K. Aggregated CdS quantum dots: Host of biomolecular ligands. The Journal of Physical Chemistry B. 110 (48), 24403-24409 (2006).
- Wang, S., et al. Endocytosis of the receptor-binding domain of SARS-CoV spike protein together with virus receptor ACE2. Virus Research. 136 (1), 8-15 (2008).
- Hildebrandt, N., et al. Energy transfer with semiconductor quantum dot bioconjugates: A versatile platform for biosensing, energy harvesting, and other developing applications. Chemical Reviews. 117 (2), 536 (2017).
