Konfokale Hochdurchsatz-Bildgebung von quantenpunktkonjugierten SARS-CoV-2-Spike-Trimern zur Verfolgung von Bindung und Endozytose in HEK293T-Zellen
Summary
In diesem Protokoll ermöglichen Quantenpunkte, die an rekombinante SARS-CoV-2-Spike konjugiert sind, zellbasierte Assays, die Spike-Bindung an hACE2 an der Plasmamembran und die anschließende Endozytose der gebundenen Proteine in das Zytoplasma zu überwachen.
Abstract
Die Entwicklung neuer Technologien für die zelluläre Fluoreszenzmikroskopie hat Hochdurchsatz-Screening-Methoden für die Wirkstoffforschung ermöglicht. Quantenpunkte sind fluoreszierende Nanopartikel mit hervorragenden photophysikalischen Eigenschaften, die von heller und stabiler Photolumineszenz sowie schmalen Emissionsbändern durchdrungen sind. Quantenpunkte haben eine kugelförmige Form und können mit der richtigen Modifikation der Oberflächenchemie verwendet werden, um Biomoleküle für zelluläre Anwendungen zu konjugieren. Diese optischen Eigenschaften, kombiniert mit der Fähigkeit, sie mit Biomolekülen zu funktionalisieren, machen sie zu einem ausgezeichneten Werkzeug für die Untersuchung von Rezeptor-Ligand-Interaktionen und zellulärem Transport. Hier stellen wir eine Methode vor, die Quantenpunkte verwendet, um die Bindung und Endozytose des SARS-CoV-2-Spike-Proteins zu verfolgen. Dieses Protokoll kann als Leitfaden für Experimentatoren verwendet werden, die Quantenpunkte verwenden möchten, um Protein-Protein-Interaktionen und -Handel im Kontext der zellulären Physiologie zu untersuchen.
Introduction
Die Fluoreszenzmikroskopie ermöglicht es Forschern, mit speziellen Farbstoffen1, genetisch kodierten fluoreszierenden Proteinen2 und fluoreszierenden Nanopartikeln in Form von Quantenpunkten (QDs)3 in das Innenleben der Zelle zu blicken. Für das schwere akute respiratorische Syndrom Coronavirus von 2019 (SARS-CoV-2) globale Pandemie haben Forscher Fluoreszenzmikroskopie eingesetzt, um zu verstehen, wie das Virus mit der Zelle sowohl an der Plasmamembran als auch im Zytoplasma interagiert. So konnten Forscher Einblicke in die Bindung des SARS-CoV-2-Spike-Proteins auf der Oberfläche des Virions an das menschliche Angiotensin-Converting-Enzym 2 (hACE2) auf der Oberfläche menschlicher Zellen, die anschließende Internalisierung durch Fusion an der Plasmamembran und die Endozytose des Spike:hACE2-Proteinkomplexes4,5 gewinnen. Große Einblicke wurden auch in das SARS-CoV-2-Austritt aus Zellen über das Lysosom unter Verwendung der zellulären Fluoreszenzbildgebung gewonnen, ein einzigartiges Merkmal von Coronaviren, von denen bisher angenommen wurde, dass sie über traditionelle Vesikelknospen aus dem Golgi auftreten, wie es bei vielen anderen Viren der Fall ist6. Die zelluläre Fluoreszenzmikroskopie-Technik, eine tragende Säule fast aller Aspekte der biologischen Forschung, hat sich in ihrer Breite und ihrem Anwendungsbereich notwendigerweise weiterentwickelt, von der hochauflösenden Bildgebung ganzer Tiere bis hin zur automatisierten multiparametrischen High-Content-Bildgebung für das Arzneimittelscreening. Hier wird eine automatisierte konfokale High-Content-Mikroskopie zur Untersuchung des SARS-CoV-2-Zelleintritts unter Verwendung fluoreszierender QDs angewendet, die mit dem viralen Spike-Protein konjugiert sind.
Die High-Content-Analyse von Bildern, die von biologischen Bildgebungsplattformen erzeugt werden, ermöglicht eine bessere Extraktion wertvoller biologischer Erkenntnisse als einzelne Parameter wie die Intensität des gesamten Bohrlochs, die man mit einem multimodalen Plattenleser erhalten würde7. Durch die Trennung der Objekte in einem Sichtfeld mithilfe automatisierter Segmentierungsalgorithmen kann jedes Objekt oder eine Population von Objekten auf Parameter wie Intensität, Fläche und Textur in jedem verfügbaren Fluoreszenzkanal analysiert werden8. Die Kombination vieler Messungen in multivariaten Datensätzen ist ein nützlicher Ansatz für die phänotypische Profilerstellung. Wenn der gewünschte Phänotyp bekannt ist, wie z.B. die QD-Internalisierung in Form von Puncta, kann man die mit Puncta verbundenen Messungen wie Größe, Anzahl und Intensität verwenden, um die Wirksamkeit einer Behandlung zu beurteilen.
Cloud-basierte High-Content-Imaging-Analysesoftware kann eine Vielzahl von Instrumentendatenausgaben aufnehmen, einschließlich der High-Content-Imaging-Plattform. Durch die Verwendung eines Cloud-basierten Servers für die Bildspeicherung und Online-Analyse kann der Benutzer seine Daten entweder vom Bildgebungsgerät oder vom Netzlaufwerk, auf dem die Daten gespeichert sind, hochladen. Der Analyseteil des Protokolls wird innerhalb der Cloud-Softwareumgebung durchgeführt, und die Daten können in einer Vielzahl von Dateiformaten für die nachgelagerte Datenvisualisierung exportiert werden.
Das SARS-CoV-2-Virus besteht aus Nichtstruktur- und Strukturproteinen, die bei seiner Montage und Replikation helfen. SARS-CoV-2-Spike hat zwei Domänen namens S1 und S2, wobei S1 die Rezeptorbindungsdomäne enthält, die für hACE2-Wechselwirkungen an der Plasmamembran verantwortlich ist9. Es wurde auch festgestellt, dass Spike mit anderen Molekülen an der Plasmamembran interagiert, die zusätzlich zu hACE210,11 als Co-Rezeptoren fungieren können. Während der gesamten Spike-Proteinsequenz und insbesondere an der S1/S2-Grenzfläche gibt es Protease-Spaltungsstellen, die eine Fusion an der Membran nach der Transmembran-Serin-Protease 2 (TMPRSS2)12 ermöglichen. Verschiedene rekombinante SARS-CoV-2-Spike-Proteine wurden aus einzelnen Rezeptorbindungsdomänen hergestellt, zu S1, S2, S1 mit S2 und ganzen Spike-Trimern von mehreren kommerziellen Anbietern für den Einsatz in Forschungsaktivitäten13.
In dieser Arbeit wurde die Oberfläche von QDs mit rekombinanten Spike-Trimern funktionalisiert, die ein Histidin-Tag (QD-Spike) enthalten. Die von der Naval Research Laboratory Optical Nanomaterials Section hergestellten QDs enthalten einen Cadmiumselenidkern und eine Zinksulfidschale14,15. Das Zink auf der QD-Oberfläche koordiniert die Histidinreste innerhalb des rekombinanten Proteins, um eine funktionalisierte QD zu bilden, die in Form und Funktion einem SARS-CoV-2-Viruspartikel ähnelt. Die Erzeugung der Nanopartikel und der Proteinkonjugation wurde zuvor unter Verwendung der QD-konjugierten Rezeptorbindungsdomäne beschrieben15. Diese Methode beschreibt die Zellkulturpräparate, die QD-Behandlung, die Bilderfassung und das Datenanalyseprotokoll, das einen Forscher bei der Untersuchung der SARS-CoV-2-Spike-Aktivität im physiologischen Kontext einer menschlichen Zelle leiten kann.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die in diesem Artikel beschriebene Methode bietet die notwendigen Schritte für die Bildgebung funktionalisierter QDs in menschlichen Zellen mittels konfokaler Hochdurchsatzmikroskopie. Diese Methode eignet sich am besten für Zellen, bei denen Endozytose der Hauptweg des viralen Eintritts und nicht die Aktivität von TMPRSS2 und Membranfusion ist, da sie die Untersuchung von SARS-CoV-2 Spike und hACE2 Endozytose ermöglicht. Aufgrund der Art des QD-Modells und des C-terminalen His-Tags auf dem kommerziell erhältlichen …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Forschung wurde zum Teil durch das Intramural Research Program des National Center for Advancing Translational Sciences, NIH, unterstützt. Das Naval Research Laboratory stellte die Finanzierung über sein internes Nanoscience Institute zur Verfügung. Die Reagenzienvorbereitung wurde über den NRL COVID-19 Basisfonds unterstützt.
Materials
| 32% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714 | Used for fixing cells after quantum dot treatment, final concentration 3.2% Used for stabilizing QDs in Optimem I and preventing non-specific interactions, final concentration 0.1% |
| 7.5% Bovine Serum Albumin | Gibco | 15260-037 | Used as a cell viability dye for fluorescence cell counting |
| Acridine Orange / Propidium Iodide Stain | Logos Biosystems | F23001 | Microwell plates used for seeding cells and assaying QD-Spike |
| Black clear bottom 96 well coated plate coated with poly-D-lysine | Greiner | 655946 | Used to support cell culture, DMEM supplement |
| Characterized Fetal Bovine Serum | Cytiva/HyClone | SH30071.03 | Cloud-based high-content image analysis software; V2.9.1 |
| Columbus Analyzer | Perkin Elmer | NA | Used for labeling cell nuclei and cell bodies after fixation, deep red nuclear dye |
| DRAQ5 (5 mM) | ThermoFisher Scientific | 62252 | Basal media for HEK293T cell culture |
| Dulbecco's Minimal Essential Media, D-glucose (4.5g/L), L-glutamine, sodium pyruvate (110 mg/L), phenol red | Gibco | 11995-065 | Used for arranging data after export from Columbus; V2110 Microsoft 365 |
| Excel | Microsoft | NA | Used to continue selection of hACE2-GFP positive cells, DMEM supplement |
| G418 | InvivoGen | ant-gn-5 | Human embryonic kidney cell line stably expression human angiotensin converting enzyme 2 tagged with GFP |
| HEK293T hACE2-GFP | Codex Biosolutions | CB-97100-203 | Automated cell counter |
| Luna Automated Cell Counter | Logos Biosystems | NA | Used for fluorescence cell counting |
| Luna Cell Counting Slides | Logos Biosystems | L12001 | High-content imaging platform |
| Opera Phenix | Perkin Elmer | NA | Imaging media, used for incubating cells with quantum dots |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 11058-021 | Phosphate-buffered saline without calcium or magnesium used for washing cells during passaging and assaying |
| PBS -/- | Gibco | 10010-023 | Used to prevent bacterial contamination of cell culture, DMEM supplement |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Used for graphing, data visualization, and statistical analysis;V9.1.0 |
| Prism | GraphPad | NA | Used for assaying SARS-Cov-2 Spike binding to hACE2 and monitoring Spike endocytosis |
| Quantum Dot 608 nm-Spike (QD608-Spike) | custom made by Naval Research Laboratory | Used for inhibition of SARS-Cov-2 Spike binding to hACE2 | |
| SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab | Sino Biological | 40592-MM57 | Used to dissociate cells from flask during passaging |
| TrypLE Express | Gibco | 12605-010 |
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