In vitro Arzneimittelscreening gegen alle Lebenszyklusstadien von Trypanosoma cruzi unter Verwendung von Parasiten, die β-Galactosidase exprimieren
Summary
Wir beschreiben einen kolorimetrischen Hochdurchsatz-Assay zur Messung der β-Galactosidase-Aktivität in drei Lebenszyklusstadien von Trypanosoma cruzi, dem Erreger der Chagas-Krankheit. Dieser Assay kann verwendet werden, um trypanozide Verbindungen auf einfache, schnelle und reproduzierbare Weise zu identifizieren.
Abstract
Trypanosoma cruzi ist der Erreger der Chagas-Krankheit (ChD), einer endemischen Krankheit von Bedeutung für die öffentliche Gesundheit in Lateinamerika, die aufgrund der Zunahme der Migration auch viele nicht-endemische Länder betrifft. Diese Krankheit betrifft fast 8 Millionen Menschen, wobei neue Fälle auf 50.000 pro Jahr geschätzt werden. In den 1960er und 70er Jahren wurden zwei Medikamente zur ChD-Behandlung eingeführt: Nifurtimox und Benznidazol (BZN). Beide sind wirksam bei Neugeborenen und während der akuten Phase der Krankheit, aber nicht in der chronischen Phase, und ihre Verwendung ist mit wichtigen Nebenwirkungen verbunden. Diese Tatsachen unterstreichen die dringende Notwendigkeit, die Suche nach neuen Medikamenten gegen T. cruzi zu intensivieren.
T. cruzi wird durch hämatophage Insektenvektoren der Familien Reduviidae und Hemiptera übertragen. Einmal im Säugetierwirt, multipliziert es sich intrazellulär als die nicht geißelte amastigote Form und differenziert sich in die Trypomastigote, die nicht-replizierende infektiöse Form des Blutkreislaufs. Innerhalb des Insektenvektors wandeln sich Trypomastigoten in das Epimastigote-Stadium um und vermehren sich durch binäre Spaltung.
Diese Arbeit beschreibt einen Assay, der auf der Messung der Aktivität der zytoplasmatischen β-Galactosidase, die aufgrund der Parasitenlyse in die Kultur freigesetzt wird, unter Verwendung des Substrats Chlorphenolrot β-D-Galactopyranosid (CPRG) basiert. Zu diesem Zweck wurde der T. cruzi Dm28c-Stamm mit einem β-Galactosidase-überexprimierenden Plasmid transfiziert und für das pharmakologische In-vitro-Screening in Epimastigote-, Trypomastigote- und Amastigote-Stadien verwendet. Dieses Papier beschreibt auch, wie man die enzymatische Aktivität in kultivierten Epimastigoten, infizierten Vero-Zellen mit Amastigoten und Trypomastigotes, die aus den kultivierten Zellen freigesetzt werden, am Beispiel des Referenzarzneimittels, Benznidazol, messen kann. Dieser kolorimetrische Assay ist einfach durchzuführen und kann auf ein Hochdurchsatzformat skaliert und auf andere T. cruzi-Stämme angewendet werden.
Introduction
Die Chagas-Krankheit (ChD) oder amerikanische Trypanosomiasis ist eine parasitäre Erkrankung, die durch den geißelten Protozoen Trypanosoma cruzi (T. cruzi) verursacht wird. ChD beginnt mit einer asymptomatischen oder oligosymptomatischen akuten Phase, die normalerweise nicht diagnostiziert wird, gefolgt von einer lebenslangen chronischen Phase. In der Chronizität manifestieren ~ 30% der Patienten Jahrzehnte nach der Infektion eine Vielzahl von schwächenden Zuständen, einschließlich Myokardiopathie, Mega-Verdauungssyndrome oder beides, mit einer Sterblichkeitsrate von 0,2% bis 20%1,2,3. Asymptomatische chronische Patienten haben möglicherweise keine klinischen Symptome, bleiben aber ihr ganzes Leben lang seropositiv.
Schätzungen zufolge sind weltweit ~ 7 Millionen Menschen infiziert, hauptsächlich aus Lateinamerika, wo ChD endemisch ist. In diesen Ländern wird T. cruzi hauptsächlich durch infizierte blutsaugende Triatomin-Käfer (vektorübertragene Übertragung) und seltener durch orale Übertragung durch die Aufnahme von Lebensmitteln übertragen, die mit Triatomin-Kot kontaminiert sind, der die Parasiten enthält2. Darüber hinaus kann der Parasit über die Plazenta von chagasischen Müttern auf Neugeborene, durch Bluttransfusionen oder während der Organtransplantation übertragen werden. Diese vektorunabhängigen Wege, die Infektion und die menschliche Migration zu erfassen, haben zur weltweiten Ausbreitung der Krankheit beigetragen, was sich in einer zunehmenden Zahl von Fällen in Nordamerika, Europa und einigen Ländern Afrikas, des östlichen Mittelmeerraums und des westlichen Pazifiks zeigt4. ChD gilt als vernachlässigte Krankheit, da die vektorübertragene Übertragung eng mit Armut verbunden ist und ein führendes Problem der öffentlichen Gesundheit ist, insbesondere in lateinamerikanischen Ländern mit niedrigem Einkommen. Obwohl es verfügbare Behandlungen gibt, ist die Mortalität aufgrund von ChD in Lateinamerika die höchste unter den parasitären Krankheiten, einschließlich Malaria2.
Es gibt zwei registrierte Medikamente für die ChD-Behandlung, die in den späten 1960er und frühen 1970er Jahren eingeführt wurden: Nifurtimox und Benznidazol5. Beide Medikamente sind in der akuten Phase der Erkrankung bei Erwachsenen, Kindern und angeborenen Neugeborenen sowie bei Kindern mit chronischer Infektion, bei denen die Heilung normalerweise erreicht wird, wirksam. Allerdings werden nur wenige Menschen früh genug diagnostiziert, um rechtzeitig behandelt zu werden. Nach den neuesten klinischen Studien haben beide Medikamente bei Erwachsenen erhebliche Einschränkungen und waren bei der Verringerung der Symptome bei Menschen mit chronischen Erkrankungen unwirksam; Daher ist ihre Verwendung in diesem Stadium umstritten. Weitere Nachteile sind die verlängerten Behandlungszeiten (60-90 Tage) und die häufigen, schwerwiegenden Nebenwirkungen, die bei einem Anteil der Infizierten 6,7 zum Absetzen der Therapie führen. Es wird geschätzt, dass weniger als 10% der Menschen mit ChD diagnostiziert wurden, und noch weniger haben Zugang zu Behandlung, da viele betroffene Personen in ländlichen Gebieten ohne oder mit knappem Zugang zur Gesundheitsversorgung leben8. Diese Tatsachen unterstreichen die dringende Notwendigkeit, neue Medikamente gegen T. cruzi zu finden, um effizientere, sicherere und auf das Feld anwendbare Behandlungen zu ermöglichen, insbesondere für die chronische Phase. In diesem Zusammenhang ist eine weitere Herausforderung bei der Entwicklung wirksamerer Verbindungen die Einschränkung von Systemen zur Bewertung der Wirksamkeit von Arzneimitteln in vitro und in vivo9.
Obwohl chemische Biologie und genomische Ansätze zur Identifizierung potenzieller Wirkstoffziele in Kinetoplastid-Parasiten verwendet wurden, sind die verfügbaren genomischen Werkzeuge in T. cruzi im Gegensatz zu T. brucei oder Leishmania begrenzt. Daher ist das Screening von Verbindungen mit trypanozidaler Aktivität immer noch der am häufigsten verwendete Ansatz bei der Suche nach neuen chemotherapeutischen Arzneimittelkandidaten gegen ChD. Normalerweise muss die Arzneimittelentdeckung in T. cruzi mit der Prüfung der Wirkungen eines neuen Arzneimittels in einem In-vitro-Assay gegen das Epimastigote-Stadium beginnen. Jahrzehntelang war die einzige Möglichkeit, die hemmenden Wirkungen von Kandidatenverbindungen auf T. cruzi zu messen, die manuelle mikroskopische Zählung, die mühsam, zeitaufwendig und bedienerabhängig ist. Darüber hinaus eignet sich dieser Ansatz für die Untersuchung einer kleinen Anzahl von Verbindungen, ist jedoch für das Hochdurchsatz-Screening großer Verbindungsbibliotheken inakzeptabel. Heutzutage beginnen viele Untersuchungen mit der Analyse einer großen Anzahl von Verbindungen unterschiedlicher Herkunft, die in vitro untersucht werden, um ihre Fähigkeit zur Hemmung des Parasitenwachstums zu testen. Sowohl kolorimetrische als auch fluorometrische Methoden wurden entwickelt, um den Durchsatz in diesen Assays zu erhöhen, die Objektivität des Screenings zu verbessern und den gesamten Prozess weniger langwierigzu machen 9.
Eine der am weitesten verbreiteten kolorimetrischen Methoden basiert auf der β-Galactosidase-Aktivität transfizierter Parasiten, die erstmals von Bucknet und Mitarbeiternbeschrieben wurde 10. Das von den rekombinanten Parasiten exprimierte β-Galactosidase-Enzym hydrolysiert das chromogene Substrat, Chlorphenolrot β-D-Galactopyranosid (CPRG), zu Chlorphenolrot, das mit einem Mikroplattenspektralphotometer leicht kolorimetrisch gemessen werden kann. So kann das Parasitenwachstum in Gegenwart einer Vielzahl von Verbindungen gleichzeitig bewertet und in Mikrotiterplatten quantifiziert werden. Diese Methode wurde angewendet, um Medikamente in Epimastigot-Formen (im Insektenvektor vorhanden), Trypomastigotes und intrazellulären Amastigotes, den Säugetierstadien des Parasiten, zu testen. Darüber hinaus sind bereits mehrere rekombinante T. cruzi-Stämme verfügbar, die mit dem pBS:CL-Neo-01/BC-X-10-Plasmid (pLacZ)10 transfiziert wurden, um das Escherichia coli-β-Galactosidase-Enzym zu exprimieren (und neue können konstruiert werden), was die Bewertung von Parasiten aus verschiedenen diskreten Typisierungseinheiten (DTUs) ermöglicht, die sich möglicherweise nicht gleichmäßig gegenüber denselben Verbindungen verhalten 10,11,12,13 . Diese Methode wurde bereits erfolgreich zur Bewertung von Verbindungen auf Aktivität gegen T. cruzi im Niedrig- und Hochdurchsatz-Screening12,13 eingesetzt. Ähnliche Ansätze wurden auch bei anderen Protozoenparasiten verwendet, darunter Toxoplasma gondii und Leishmania mexicana14,15.
Dieses Papier beschreibt und zeigt eine detaillierte Methode für ein In-vitro-Arzneimittelscreening gegen alle Lebenszyklusstadien von T. cruzi unter Verwendung von Parasiten, die β-Galactosidase exprimieren. Die hier vorgestellten Assays wurden mit einer β-Galactosidase-exprimierenden T. cruzi-Linie durchgeführt, die durch Transfektion von T. cruzi Dm28c-Stamm aus DTU I13 mit pLacZ-Plasmid (Dm28c/pLacZ) erhalten wurde. Darüber hinaus könnte das gleiche Protokoll leicht an andere Stämme angepasst werden, um die Leistung zwischen Verbindungen und zwischen T. cruzi-Stämmen oder DTUs zu vergleichen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Papier beschreibt einen Assay, der auf der Bestimmung der zytoplasmatischen β-Galactosidase-Aktivität basiert, die aufgrund der Membranlyse von T. cruzi epimastigotes, Trypomastigotes oder infizierten Zellen mit Amastigotes in Gegenwart des Substrats CPRG freigesetzt wird. Wir verwendeten T. cruzi Dm28c/pLacZ-Parasiten, einen stabilen Parasitenstamm, der nach Transfektion mit einem β-Galactosidase-tragenden Plasmid erhalten wurde, das von Buckner und Co-Autoren10 konstr…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Dr. Buckner für die freundliche Bereitstellung des pLacZ-Plasmids. Diese Arbeit wurde von der Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica, dem Ministerio de Ciencia e Innovación Productiva aus Argentinien (PICT2016-0439, PICT2019-0526, PICT2019-4212) und dem Research Council United Kingdom [MR/P027989/1] unterstützt. Servier Medical Art wurde verwendet, um Abbildung 1 (https://smart.servier.com) zu erstellen.
Materials
| 1 L beaker | Schott Duran | 10005227 | |
| 10 mL serological pipette sterile | Jet Biofil | GSP211010 | |
| 5 mL serological pipette sterile | Jet Biofil | GSP010005 | |
| 96-well plates | Corning | 3599 | |
| Benznidazole | Sigma Aldrich | 419656 | N-Benzyl-2-nitro-1H-imidazole-1-acetamide |
| Biosafty Cabinet | Telstar | Bio II A/P | |
| Centrifuge tube 15 mL conical bottom sterile | Tarson | 546021 | |
| Centrifuge tube 50 mL conical bottom sterile | Tarson | 546041 | |
| CO2 Incubator | Sanyo | MCO-15A | |
| CPRG | Roche | 10 884308001 | Chlorophenol Red-β-D-galactopyranoside |
| DMEM, High Glucose | Thermo Fisher Cientific | 12100046 | Powder |
| DMSO | Sintorgan | SIN-061 | Dimethylsulfoxid |
| Fetal Calf Serum | Internegocios SA | FCS FRA 500 | Sterile and heat-inactivated |
| G418 disulphate salt solution | Roche | G418-RO | stock concentration: 50 mg/mL |
| Glucose D(+) | Cicarelli | 716214 | |
| Graduated cylinder | Nalgene | 3663-1000 | |
| Hemin | Frontier Scientific | H651-9 | |
| KCl | Cicarelli | 867212 | |
| Liver Infusion | Difco | 226920 | |
| Microcentrifuge tube 1.5 mL | Tarson | 500010-N | |
| Microplate Spectrophotometer | Biotek | Synergy HTX | |
| Na2HPO4 | Cicarelli | 834214 | |
| NaCl | Cicarelli | 750214 | |
| Neubauer chamber | Boeco | BOE 01 | |
| Nonidet P-40 | Antrace | NIDP40 | 2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol |
| Prism | Graphpad | Statistical Analysis software | |
| Sodium Bicarbonate | Cicarelli | 929211 | NaHCO3 |
| Sorvall ST 16 Centrifuge | Thermo Fisher Cientific | 75004380 | |
| T-25 flasks | Corning | 430639 | |
| Tryptose | Merck | 1106760500 | |
| Vero cells | ATCC | CRL-1587 |
Riferimenti
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