In vitro Screening farmacologico contro tutte le fasi del ciclo di vita di Trypanosoma cruzi utilizzando parassiti che esprimono β-galattosidasi
Summary
Descriviamo un saggio colorimetrico ad alto rendimento che misura l’attività β-galattosidasi in tre fasi del ciclo di vita di Trypanosoma cruzi, l’agente eziologico della malattia di Chagas. Questo test può essere utilizzato per identificare i composti tripanocidi in modo facile, veloce e riproducibile.
Abstract
Trypanosoma cruzi è l’agente eziologico della malattia di Chagas (ChD), una malattia endemica di importanza per la salute pubblica in America Latina che colpisce anche molti paesi non endemici a causa dell’aumento della migrazione. Questa malattia colpisce quasi 8 milioni di persone, con nuovi casi stimati in 50.000 all’anno. Negli anni 1960 e ’70, sono stati introdotti due farmaci per il trattamento della ChD: nifurtimox e benznidazolo (BZN). Entrambi sono efficaci nei neonati e durante la fase acuta della malattia ma non nella fase cronica, e il loro uso è associato a importanti effetti collaterali. Questi fatti sottolineano l’urgente necessità di intensificare la ricerca di nuovi farmaci contro T. cruzi.
T. cruzi è trasmesso attraverso insetti vettori ematofagi delle famiglie Reduviidae ed Hemiptera. Una volta nell’ospite mammifero, si moltiplica intracellulare come forma amastigote non flagellata e si differenzia nella tripomastigote, la forma infettiva non replicativa del flusso sanguigno. All’interno dell’insetto vettore, i tripomastigoti si trasformano nello stadio epimastigote e si moltiplicano attraverso la fissione binaria.
Questo articolo descrive un test basato sulla misurazione dell’attività della β-galattosidasi citoplasmatica rilasciata nella coltura a causa della lisi dei parassiti utilizzando il substrato, clorofenolo rosso β-D-galattopiranoside (CPRG). Per questo, il ceppo T. cruzi Dm28c è stato trasfettato con un plasmide sovraespressivo β-galattosidasi e utilizzato per lo screening farmacologico in vitro negli stadi epimastigote, tripomastigote e amastigote. Questo articolo descrive anche come misurare l’attività enzimatica in epimastigoti in coltura, cellule Vero infette con amastigoti e tripomastigoti rilasciati dalle cellule coltivate utilizzando il farmaco di riferimento, il benznidazolo, come esempio. Questo test colorimetrico è facilmente eseguibile e può essere scalato in un formato ad alta produttività e applicato ad altri ceppi di T. cruzi .
Introduction
La malattia di Chagas (ChD), o tripanosomiasi americana, è una malattia parassitaria causata dal protozoo flagellato, Trypanosoma cruzi (T. cruzi). ChD inizia con una fase acuta asintomatica o oligosintomatica che di solito non viene diagnosticata, seguita da una fase cronica permanente. Nella cronicità, ~ 30% dei pazienti manifesta – decenni dopo l’infezione – una varietà di condizioni debilitanti, tra cui miocardiopatia, sindromi mega-digestive, o entrambe, con un tasso di mortalità che va dallo 0,2% al 20% 1,2,3. I pazienti cronici asintomatici possono non avere segni clinici, ma rimangono sieropositivi per tutta la vita.
Le stime suggeriscono che circa 7 milioni di persone sono infette in tutto il mondo, per lo più dall’America Latina, dove la ChD è endemica. In questi paesi, T. cruzi viene trasmesso principalmente attraverso insetti triatomine infetti succhiatori di sangue (trasmissione trasmessa da vettori) e meno frequentemente per trasmissione orale attraverso l’ingestione di alimenti contaminati da feci di triatomina contenenti i parassiti2. Inoltre, il parassita può essere trasmesso attraverso la placenta dalle madri chagasic ai neonati, attraverso trasfusioni di sangue o durante il trapianto di organi. Questi modi indipendenti dal vettore di acquisire l’infezione e la migrazione umana hanno contribuito alla diffusione mondiale della malattia, evidenziata da un numero crescente di casi in Nord America, Europa e alcuni paesi africani, del Mediterraneo orientale e del Pacifico occidentale4. La ChD è considerata una malattia trascurata in quanto la trasmissione trasmessa da vettori è strettamente associata alla povertà ed è un importante problema di salute pubblica, specialmente nei paesi a basso reddito dell’America Latina. Sebbene ci siano trattamenti disponibili, la mortalità dovuta a ChD in America Latina è la più alta tra le malattie parassitarie, tra cui la malaria2.
Ci sono due farmaci registrati per il trattamento ChD introdotti alla fine del 1960 e all’inizio del 1970: nifurtimox e benznidazolo5. Entrambi i farmaci sono efficaci nella fase acuta della malattia negli adulti, nei bambini e nei neonati congenitamente infetti, così come nei bambini con infezione cronica, dove di solito si ottiene la cura. Tuttavia, solo poche persone vengono diagnosticate abbastanza presto da essere trattate in tempo. Secondo gli ultimi studi clinici, entrambi i farmaci hanno importanti limitazioni negli adulti e sono stati inefficaci nel ridurre i sintomi nelle persone con malattie croniche; quindi, il loro uso in questa fase è controverso. Altri inconvenienti sono i periodi di trattamento prolungati richiesti (60-90 giorni) e gli effetti avversi frequenti e gravi osservati, che portano all’interruzione della terapia in una percentuale di persone infette 6,7. Si stima che meno del 10% delle persone con ChD siano state diagnosticate e ancora meno abbiano accesso alle cure, poiché molti individui affetti vivono in aree rurali con accesso assente o scarso all’assistenza sanitaria8. Questi fatti evidenziano l’urgente necessità di trovare nuovi farmaci contro T. cruzi per consentire trattamenti più efficienti, sicuri e applicabili al campo, specialmente per la fase cronica. A questo proposito, un’altra sfida nello sviluppo di composti più efficaci è la limitazione dei sistemi per valutare l’efficacia dei farmaci in vitro e in vivo9.
Sebbene la biologia chimica e gli approcci genomici per l’identificazione di potenziali bersagli farmacologici siano stati utilizzati nei parassiti kinetoplastidi, gli strumenti genomici disponibili in T. cruzi sono limitati in contrasto con T. brucei o Leishmania. Pertanto, lo screening di composti con attività tripanocida è ancora l’approccio più utilizzato nella ricerca di nuovi candidati farmaci chemioterapici contro ChD. Di solito, la scoperta di farmaci in T. cruzi deve iniziare con il test degli effetti di un nuovo farmaco in un test in vitro contro lo stadio epimastigote. Per decenni, l’unico modo per misurare gli effetti inibitori dei composti candidati su T. cruzi era il conteggio microscopico manuale, che è laborioso, dispendioso in termini di tempo e dipendente dall’operatore. Inoltre, questo approccio è adatto per l’analisi di un piccolo numero di composti, ma è inaccettabile per lo screening ad alto rendimento di grandi librerie di composti. Al giorno d’oggi, molte indagini iniziano con l’analisi di un vasto numero di composti di origini diverse che vengono analizzati in vitro, testando la loro capacità di inibire la crescita dei parassiti. Sono stati sviluppati sia metodi colorimetrici che fluorometrici per aumentare la produttività in questi saggi, migliorando l’obiettività dello screening e rendendo l’intero processo meno noioso9.
Uno dei metodi colorimetrici più utilizzati si basa sull’attività β-galattosidasi dei parassiti trasfettati descritti per la prima volta da Bucknet e dai collaboratori10. L’enzima β-galattosidasi espresso dai parassiti ricombinanti idrolizza il substrato cromogenico, il clorofenolo rosso β-D-galattopiranoside (CPRG), al rosso clorofenolo, che può essere facilmente misurato colorimetricamente utilizzando uno spettrofotometro a micropiastre. Pertanto, la crescita del parassita in presenza di una varietà di composti può essere simultaneamente valutata e quantificata in piastre di microtitolazione. Questo metodo è stato applicato per testare farmaci in forme epimastigote (presenti nell’insetto vettore), tripomastigoti e amastigoti intracellulari, gli stadi mammiferi del parassita. Inoltre, sono già disponibili diversi ceppi di T. cruzi ricombinanti trasfettati con il plasmide pBS:CL-Neo-01/BC-X-10 (pLacZ)10 per esprimere l’enzima Escherichia coli β-galattosidasi (e ne possono essere costruiti di nuovi), che consente la valutazione di parassiti provenienti da diverse unità di tipizzazione discreta (DTU) che potrebbero non comportarsi allo stesso modo verso gli stessi composti 10,11,12,13 . Questo metodo è già stato utilizzato con successo per valutare i composti per l’attività contro T. cruzi nello screening a bassa e alta produttività12,13. Approcci simili sono stati utilizzati anche in altri parassiti protozoari, tra cui Toxoplasma gondii e Leishmania mexicana14,15.
Questo documento descrive e mostra un metodo dettagliato per uno screening farmacologico in vitro contro tutte le fasi del ciclo di vita di T. cruzi utilizzando parassiti che esprimono β-galattosidasi. I saggi qui presentati sono stati eseguiti con una linea di T. cruzi che esprime β galattosidasi ottenuta per trasfezione del ceppo T. cruzi Dm28c da DTU I13 con plasmide pLacZ (Dm28c/pLacZ). Inoltre, lo stesso protocollo potrebbe essere facilmente adattato ad altri ceppi per confrontare le prestazioni tra composti e tra ceppi di T. cruzi o DTU.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo articolo descrive un test basato sulla determinazione dell’attività citoplasmatica β-galattosidasi rilasciata a causa della lisi di membrana di T. cruzi epimastigotes, tripomastigotes o cellule infette con amastigoti in presenza del substrato CPRG. Abbiamo usato i parassiti T. cruzi Dm28c/pLacZ, un ceppo parassitario stabile ottenuto dopo la trasfezione con un plasmide portatore di β-galattosidasi costruito da Buckner e co-autori10. Questo test è stato utilizzato per l…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo il Dr. Buckner per aver gentilmente fornito il plasmide pLacZ. Questo lavoro è stato sostenuto da Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica, Ministerio de Ciencia e Innovación Productiva dall’Argentina (PICT2016-0439, PICT2019-0526, PICT2019-4212) e Research Council United Kingdom [MR/P027989/1]. Servier Medical Art è stato utilizzato per produrre la Figura 1 (https://smart.servier.com).
Materials
| 1 L beaker | Schott Duran | 10005227 | |
| 10 mL serological pipette sterile | Jet Biofil | GSP211010 | |
| 5 mL serological pipette sterile | Jet Biofil | GSP010005 | |
| 96-well plates | Corning | 3599 | |
| Benznidazole | Sigma Aldrich | 419656 | N-Benzyl-2-nitro-1H-imidazole-1-acetamide |
| Biosafty Cabinet | Telstar | Bio II A/P | |
| Centrifuge tube 15 mL conical bottom sterile | Tarson | 546021 | |
| Centrifuge tube 50 mL conical bottom sterile | Tarson | 546041 | |
| CO2 Incubator | Sanyo | MCO-15A | |
| CPRG | Roche | 10 884308001 | Chlorophenol Red-β-D-galactopyranoside |
| DMEM, High Glucose | Thermo Fisher Cientific | 12100046 | Powder |
| DMSO | Sintorgan | SIN-061 | Dimethylsulfoxid |
| Fetal Calf Serum | Internegocios SA | FCS FRA 500 | Sterile and heat-inactivated |
| G418 disulphate salt solution | Roche | G418-RO | stock concentration: 50 mg/mL |
| Glucose D(+) | Cicarelli | 716214 | |
| Graduated cylinder | Nalgene | 3663-1000 | |
| Hemin | Frontier Scientific | H651-9 | |
| KCl | Cicarelli | 867212 | |
| Liver Infusion | Difco | 226920 | |
| Microcentrifuge tube 1.5 mL | Tarson | 500010-N | |
| Microplate Spectrophotometer | Biotek | Synergy HTX | |
| Na2HPO4 | Cicarelli | 834214 | |
| NaCl | Cicarelli | 750214 | |
| Neubauer chamber | Boeco | BOE 01 | |
| Nonidet P-40 | Antrace | NIDP40 | 2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol |
| Prism | Graphpad | Statistical Analysis software | |
| Sodium Bicarbonate | Cicarelli | 929211 | NaHCO3 |
| Sorvall ST 16 Centrifuge | Thermo Fisher Cientific | 75004380 | |
| T-25 flasks | Corning | 430639 | |
| Tryptose | Merck | 1106760500 | |
| Vero cells | ATCC | CRL-1587 |
Riferimenti
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