Modelli animali ex vivo e in vivo per lesioni meccaniche e chimiche dell'epitelio corneale

Summary

Qui, vengono sviluppati modelli animali basati su topo e coniglio per il danno meccanico e chimico dell’epitelio corneale per lo screening di nuove terapie e del meccanismo sottostante.

Abstract

Le lesioni corneali alla superficie oculare, comprese ustioni chimiche e traumi, possono causare gravi cicatrici, symblepharon, deficit di cellule staminali dell’apparato limbare corneale e provocare un difetto epiteliale corneale grande e persistente. Il difetto epiteliale con la seguente opacità corneale e la neovascolarizzazione periferica provocano una compromissione visiva irreversibile e ostacolano la gestione futura, in particolare la cheratoplastica. Poiché il modello animale può essere utilizzato come un’efficace piattaforma di sviluppo di farmaci, qui vengono sviluppati modelli di lesioni corneali al topo e bruciature alcaline all’epitelio corneale del coniglio. Il coniglio bianco della Nuova Zelanda viene utilizzato nel modello di bruciatura alcalina. Diverse concentrazioni di idrossido di sodio possono essere applicate sull’area circolare centrale della cornea per 30 s in anestesia intramuscolare e topica. Dopo abbondante irrigazione salina normale isotonica, l’epitelio corneale sciolto residuo è stato rimosso con bava corneale in profondità fino allo strato di Bowman all’interno di questa area circolare. La guarigione delle ferite è stata documentata dalla colorazione con fluoresceina sotto luce blu cobalto. I topi C57BL / 6 sono stati utilizzati nel modello traumatico dell’epitelio corneale murino. La cornea centrale murina è stata marcata usando un pugno di pelle, 2 mm di diametro, e poi sbrigliata da un dispositivo di rimozione dell’anello di ruggine corneale con una bava di 0,5 mm sotto uno stereomicroscopio. Questi modelli possono essere utilizzati prospetticamente per convalidare l’effetto terapeutico di colliri o agenti misti come le cellule staminali, che potenzialmente facilitano la rigenerazione epiteliale corneale. Osservando l’opacità corneale, la neovascolarizzazione periferica e la congestione congiuntivale con stereomicroscopio e software di imaging, è possibile monitorare gli effetti terapeutici in questi modelli animali.

Introduction

La cornea umana è costituita da cinque strati principali e svolge un ruolo fondamentale nella rifrazione oculare per mantenere l’acuità visiva e l’integrità strutturale per proteggere i tessuti intraoculari¹. La parte più esterna della cornea è l’epitelio corneale, composto da cinque a sei strati di cellule che si differenziano sequenzialmente dalle cellule basali e si spostano verso l’alto per liberarsi dalla superficie oculare¹. Rispetto alla cornea negli esseri umani e nei conigli neozelandesi, la cornea del topo ha una struttura corneale simile, ma una periferia più sottile rispetto alla parte centrale a causa di uno spessore ridotto nell’epitelio e nello stroma². A causa della sua posizione unica nel sistema ottico oculare, molti insulti esterni come lesioni meccaniche, inoculazione batterica e agenti chimici possono facilmente mettere in pericolo l’integrità epiteliale e portare ulteriormente a difetti dell’epitelio che minacciano la vista, cheratite infettiva, fusione corneale e persino perforazione corneale.

Sebbene vari agenti terapeutici, come lubrificanti, antibiotici, agenti antinfiammatori, prodotti auto-sierici e membrana amniotica siano già stati utilizzati per migliorare la riepitelizzazione e ridurre le cicatrici, altre potenziali modalità di trattamento che possono consentire la guarigione delle ferite, ridurre l’infiammazione e sopprimere la formazione di cicatrici sono ancora in fase di sviluppo e test su piattaforme diverse. Sono stati proposti vari modelli animali per la guarigione delle ferite epiteliali corneali, tra cui la rimozione dell’epitelio corneale con un dispositivo di rimozione dell’anello di ruggine corneale nel topo diabetico³, graffi lineari sull’epitelio corneale del topo con un ago sterile da 25 G per l’inoculazione batterica⁴, rimozione assistita da trefina dell’epitelio corneale mediante rimozione dell’anello di ruggine corneale⁵, cauterizzazione epiteliale su metà della cornea e del limbus⁶ , l’abrasione corneale del coniglio facilitata da trephine da una lama di bisturi opaca⁷ e la lesione della cornea bovina mediante congelamento improvviso in azoto liquido⁸.

Oltre alle lesioni meccaniche all’epitelio corneale, gli agenti chimici sono anche insulti comuni alla superficie oculare, in particolare agenti acidi e alcalini. L’idrossido di sodio (NaOH, 0,1-1 N per 30-60 s) è una delle sostanze chimiche comunemente usate nei modelli murini e di coniglio di ustione chimica corneale 9,10,11,12,13. L’etanolo al 100% era stato applicato anche alla cornea nel modello di ustione chimica del ratto, seguito da un’ulteriore rottamazione meccanica utilizzando una lama chirurgica¹⁴. Poiché il mantenimento di una superficie oculare sana si basa su unità funzionali, tra cui le palpebre, le ghiandole di Meibomio, il sistema lacrimale, la congiuntiva e la cornea, i modelli animali di vivo hanno alcuni meriti rispetto alle cellule epiteliali corneali in coltura ex vivo o ai tessuti corneali. In questo articolo vengono dimostrati il modello murino della ferita da abrasione corneale e il modello di coniglio dell’ustione alcalina corneale.

Protocol

Tutte le procedure sperimentali negli studi sugli animali sono state approvate dal Comitato etico di ricerca presso il Chang Gung Memorial Hospital e hanno aderito alla dichiarazione ARVO per l’uso di animali nella ricerca oftalmica e visiva. 1. Modello di guarigione ex vivo dell’epitelio corneale di topo Preparazione dei topiSomministrare l’anestesia generale ai topi C57BL/6 mediante somministrazione intraperitoneale di ketamina cloridrato (80-100 m…

Representative Results

Modello di guarigione ex vivo dell’epitelio corneale del topo:Dopo lo sbrigliamento in vivo dell’epitelio corneale di topo con rimozione dell’anello antiruggine corneale portatile, nell’area centrale di 2 mm si trova un’area corneale centrale leggermente depressa con colorazione di fluoresceina (Figura 3A-B). Dopo aver raccolto il bulbo oculare del topo, è stato facilmente fissato su una piastra di col…

Discussion

I modelli murini e di coniglio di lesioni corneali forniscono un’utile piattaforma ex vivo e in vivo per monitorare la guarigione delle ferite, testare nuove terapie e studiare i meccanismi sottostanti alla guarigione delle ferite e ai percorsi di trattamento. Diversi modelli animali possono essere utilizzati per un esperimento a breve o lungo termine, a seconda dello scopo della ricerca. Ad esempio, dopo aver creato un difetto epiteliale sulla cornea del topo in vivo, un difetto epiteliale con…

Materials

6/0 Ethicon vicryl suture	Ethicon	6/0VICRYL	tarsorrhaphy
Barraquer lid speculum	katena	K1-5355	15 mm
Barraquer needle holder	Katena	K6-3310	without lock
Barron Vacuum Punch 8.0 mm	katena	K20-2108	for cutting filter paper
C57BL/6 mice	National Laboratory Animal Center	RMRC11005	mouse strain
Castroviejo forceps 0.12 mm	katena	K5-2500
Corneal rust ring remover with 0.5 mm burr	Algerbrush IITM; Alger Equipment Co., Inc. Lago Vista, TX	CHI-675	for debridement of the corneal epithelium
Filter paper	Toyo Roshi Kaisha,Ltd.	1.11
Fluorescein sodum ophthalmic strips U.S.P	OPTITECH	OPTFL100	staining for corneal epithelial defect
Ketamine hydrochloride	Sigma-Aldrich	61763-23-3	intraperitoneal or intramuscular anesthetics
New Zealand White Rabbits	Livestock Research Institute, Council of Agriculture,Executive Yuan		Rabbit models
Normal saline	TAIWAN BIOTECH CO., LTD.	100-120-1101
Proparacaine	Alcon	ALC2UD09	topical anesthetics
Skin biopsy punch 2mm	STIEFEL	22650
Sodium chloride (NaOH)	Sigma-Aldrich	1310-73-2	a chemical agent for alkali burn
Stereomicroscope	Carl Zeiss Meditec, Dublin, CA	SV11	microscope for surgery
Westcott Tenotomy Scissors Medium	katena	K4-3004
Xylazine hydrochloride 23.32 mg/10 mL	Elanco animal health Korea Co., LTD.	047-956	intraperitoneal or intramuscular anesthetics