Kornea Epitelinin Mekanik ve Kimyasal Yaralanmaları için Ex Vivo ve In Vivo Hayvan Modelleri
Summary
Burada, kornea epitelinin mekanik ve kimyasal hasarı için fare ve tavşana dayalı hayvan modelleri, yeni terapötikleri ve altta yatan mekanizmayı taramak için geliştirilmiştir.
Abstract
Kimyasal yanık ve travma da dahil olmak üzere oküler yüzeyde kornea hasarı, ciddi skarlaşma, simblefaron, kornea limbal kök hücre eksikliğine neden olabilir ve büyük, kalıcı bir kornea epitel defektine neden olabilir. Aşağıdaki kornea opaklığı ve periferik neovaskülarizasyon ile birlikte epitel defekti geri dönüşümsüz görme bozukluğuna neden olur ve başta keratoplasti olmak üzere gelecekteki tedaviyi engeller. Hayvan modeli etkili bir ilaç geliştirme platformu olarak kullanılabildiğinden, burada farede kornea yaralanması ve tavşan kornea epiteline alkali yanık modelleri geliştirilmiştir. Yeni Zelanda beyaz tavşanı alkali yanık modelinde kullanılır. Farklı konsantrasyonlarda sodyum hidroksit, korneanın merkezi dairesel bölgesine kas içi ve topikal anestezi altında 30 s boyunca uygulanabilir. Bol miktarda izotonik normal salin irrigasyonundan sonra, artık gevşek kornea epiteli, bu dairesel alan içinde Bowman tabakasının derinliklerine kadar kornea çapağı ile çıkarıldı. Yara iyileşmesi, Kobalt mavi ışığı altında floresein boyaması ile belgelenmiştir. C57BL/6 fareler murin kornea epitelinin travmatik modelinde kullanıldı. Murin merkezi kornea, 2 mm çapında bir cilt zımbası kullanılarak işaretlendi ve daha sonra stereomikroskop altında 0.5 mm’lik bir çapak ile kornea pas halkası sökücü ile debride edildi. Bu modeller, göz damlalarının veya potansiyel olarak kornea epitel rejenerasyonunu kolaylaştıran kök hücreler gibi karışık ajanların terapötik etkisini doğrulamak için prospektif olarak kullanılabilir. Stereomikroskop ve görüntüleme yazılımı ile kornea opaklığı, periferik neovaskülarizasyon ve konjonktiva tıkanıklığı gözlenerek bu hayvan modellerinde terapötik etkiler izlenebilir.
Introduction
İnsan korneası beş ana tabakadan oluşur ve göz içi dokuları korumak için görme keskinliğini ve yapısal bütünlüğü korumak için oküler refraksiyonda önemli bir rol oynar1. Korneanın en dış kısmı, bazal hücrelerden sırayla farklılaşan ve oküler yüzey1’den dökülmek üzere yukarı doğru hareket eden beş ila altı hücre katmanından oluşan kornea epitelidir. İnsanlarda ve Yeni Zelanda tavşanlarında kornea ile karşılaştırıldığında, fare korneası benzer bir kornea yapısına sahiptir, ancak epitel ve stroma2’deki kalınlığın azalması nedeniyle orta kısımdan daha ince bir çevreye sahiptir. Oküler optik sistemdeki benzersiz konumu nedeniyle, mekanik yaralanma, bakteriyel aşılama ve kimyasal ajanlar gibi birçok dış hakaret, epitel bütünlüğünü kolayca tehlikeye atabilir ve ayrıca görmeyi tehdit eden epitel defekti, enfeksiyöz keratit, kornea erimesi ve hatta kornea perforasyonuna yol açabilir.
Kayganlaştırıcılar, antibiyotikler, antienflamatuar ajanlar, oto-serum ürünleri ve amniyotik membran gibi çeşitli terapötik ajanlar yeniden epitelizasyonu iyileştirmek ve skarlaşmayı azaltmak için zaten kullanılmış olsa da, yara iyileşmesini sağlayabilecek, inflamasyonu azaltabilecek ve skar oluşumunu baskılayabilecek diğer potansiyel tedavi yöntemleri hala farklı platformlarda geliştirilmekte ve test edilmektedir. Diyabetik fare3’te kornea pas halkası sökücü ile kornea epitelinin çıkarılması, bakteriyel aşılama için steril 25 G iğne ile fare kornea epiteli üzerinde doğrusal çizikler 4, kornea pas halkası sökücü5 ile kornea epitelinin trefin yardımlı çıkarılması, korneanın yarısından fazlasında epitel koter ve limbus6 dahil olmak üzere kornea epitelinin yara iyileşmesiiçin çeşitli hayvan modelleri önerilmiştir , donuk bir neşter bıçağı7 ile trefin ile kolaylaştırılmış tavşan kornea aşınması ve sıvı azotta ani donma ile sığır kornea yaralanması8.
Kornea epitelindeki mekanik yaralanma dışında, kimyasal ajanlar da oküler yüzeye, özellikle asidik ve alkali ajanlara yaygın olarak rastlanan hakaretlerdir. Sodyum hidroksit (NaOH, 30-60 s için 0.1-1 N), kornea kimyasal yanığı 9,10,11,12,13’ün murin ve tavşan modellerinde yaygın olarak kullanılan kimyasallardan biridir. Sıçan kimyasal yanık modelinde korneaya da %100 etanol uygulanmış, bunu cerrahi bıçak14 kullanılarak ek mekanik kazıma yapılmıştır. Sağlıklı bir oküler yüzeyin bakımı, göz kapakları, Meibomian bezleri, lakrimal sistem, konjonktiva ve kornea dahil olmak üzere fonksiyonel birimlere dayandığından, in vivo hayvan modellerinin ex vivo kültürlü kornea epitel hücreleri veya kornea dokuları üzerinde bazı yararları vardır. Bu makalede, kornea aşınma yarasının fare modeli ve kornea alkali yanığının tavşan modeli gösterilmiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kornea yaralanmasının fare ve tavşan modelleri, yara iyileşmesini izlemek, yeni terapötikleri test etmek ve yara iyileşmesi ve tedavi yollarının altında yatan mekanizmaları incelemek için yararlı bir ex vivo ve in vivo platform sağlar. Araştırmanın amacına bağlı olarak kısa süreli veya uzun vadeli bir deney için farklı hayvan modelleri kullanılabilir. Örneğin, in vivo fare korneasında bir epitel defekti oluşturulduktan sonra, sıvı terapötik ajanları küçük bir …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Çalışma, Tayvan Atom Enerjisi Konseyi (Hibe No. A-IE-01-03-02-02), Bilim ve Teknoloji Bakanlığı (Hibe No. NMRPG3E6202-3) ve Chang Gung Tıbbi Araştırma Projesi (Hibe No. CMRPG3H1281).
Materials
| 6/0 Ethicon vicryl suture | Ethicon | 6/0VICRYL | tarsorrhaphy |
| Barraquer lid speculum | katena | K1-5355 | 15 mm |
| Barraquer needle holder | Katena | K6-3310 | without lock |
| Barron Vacuum Punch 8.0 mm | katena | K20-2108 | for cutting filter paper |
| C57BL/6 mice | National Laboratory Animal Center | RMRC11005 | mouse strain |
| Castroviejo forceps 0.12 mm | katena | K5-2500 | |
| Corneal rust ring remover with 0.5 mm burr | Algerbrush IITM; Alger Equipment Co., Inc. Lago Vista, TX | CHI-675 | for debridement of the corneal epithelium |
| Filter paper | Toyo Roshi Kaisha,Ltd. | 1.11 | |
| Fluorescein sodum ophthalmic strips U.S.P | OPTITECH | OPTFL100 | staining for corneal epithelial defect |
| Ketamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 61763-23-3 | intraperitoneal or intramuscular anesthetics |
| New Zealand White Rabbits | Livestock Research Institute, Council of Agriculture,Executive Yuan | Rabbit models | |
| Normal saline | TAIWAN BIOTECH CO., LTD. | 100-120-1101 | |
| Proparacaine | Alcon | ALC2UD09 | topical anesthetics |
| Skin biopsy punch 2mm | STIEFEL | 22650 | |
| Sodium chloride (NaOH) | Sigma-Aldrich | 1310-73-2 | a chemical agent for alkali burn |
| Stereomicroscope | Carl Zeiss Meditec, Dublin, CA | SV11 | microscope for surgery |
| Westcott Tenotomy Scissors Medium | katena | K4-3004 | |
| Xylazine hydrochloride 23.32 mg/10 mL | Elanco animal health Korea Co., LTD. | 047-956 | intraperitoneal or intramuscular anesthetics |
Riferimenti
- Sridhar, M. S. Anatomy of cornea and ocular surface. Indian Journal of Ophthalmology. 66 (2), 190-194 (2018).
- Henriksson, J. T., McDermott, A. M., Bergmanson, J. P. G. Dimensions and morphology of the cornea in three strains of mice. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (8), 3648-3654 (2009).
- Wang, X., et al. MANF promotes diabetic corneal epithelial wound healing and nerve regeneration by attenuating hyperglycemia-induced endoplasmic reticulum stress. Diabetes. 69 (6), 1264-1278 (2020).
- Ma, X., et al. Corneal epithelial injury-induced norepinephrine promotes Pseudomonas aeruginosa keratitis. Experimental Eye Research. 195, 108048 (2020).
- Chan, M. F., Werb, Z. Animal models of corneal injury. Bio Protocol. 5 (13), 1516 (2015).
- Lan, Y., et al. Kinetics and function of mesenchymal stem cells in corneal injury. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (7), 3638-3644 (2012).
- Watanabe, M., et al. Promotion of corneal epithelial wound healing in vitro and in vivo by annexin A5. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (5), 1862-1868 (2006).
- Murataeva, N., et al. Cannabinoid CB2R receptors are upregulated with corneal injury and regulate the course of corneal wound healing. Experimental Eye Research. 182, 74-84 (2019).
- Carter, K., et al. Characterizing the impact of 2D and 3D culture conditions on the therapeutic effects of human mesenchymal stem cell secretome on corneal wound healing in vitro and ex vivo. Acta Biomaterialia. 99, 247-257 (2019).
- Sanie-Jahromi, F., et al. Propagation of limbal stem cells on polycaprolactone and polycaprolactone/gelatin fibrous scaffolds and transplantation in animal model. Bioimpacts. 10 (1), 45-54 (2020).
- Sun, M. M., et al. Epithelial membrane protein (EMP2) antibody blockade reduces corneal neovascularization in an In vivo model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 60 (1), 245-254 (2019).
- Yang, Y., et al. Cannabinoid receptor 1 suppresses transient receptor potential vanilloid 1-induced inflammatory responses to corneal injury. Cell Signal. 25 (2), 501-511 (2013).
- Bai, J. Q., Qin, H. F., Zhao, S. H. Research on mouse model of grade II corneal alkali burn. International Journal of Ophthalmology. 9 (4), 487-490 (2016).
- Oh, J. Y., et al. Anti-inflammatory protein TSG-6 reduces inflammatory damage to the cornea following chemical and mechanical injury. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (39), 16875 (2010).
- Wang, T., et al. Evaluation of the effects of biohcly in an in vivo model of mechanical wounds in the rabbit cornea. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 35 (3), 189-199 (2019).
- Gong, Y., et al. Effect of nintedanib thermos-sensitive hydrogel on neovascularization in alkali burn rat model. International Journal of Ophthalmology. 13 (6), 879-885 (2020).
- Yao, L., et al. Role of mesenchymal stem cells on cornea wound healing induced by alkali burn. PLoS One. 7 (2), 30842 (2012).
