JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochimica

في المختبر توصيف مرافقي هيستون باستخدام المقايسات التحليلية والمنسدلة والمرافقة

Published: December 29, 2021
doi:
10.3791/63218
, , , , , , , , ,
1Institute of Life Sciences, 2Regional Centre for Biotechnology, 3School of Biotechnology,KIIT University, 4Department of Molecular Biophysics and Biochemistry,Yale University, 5Department of Pharmacology,University of Vermont College of Medicine

Summary

يصف هذا البروتوكول مجموعة من الطرق التي تتضمن كروماتوغرافيا استبعاد الحجم التحليلي لدراسة قلة القلة واستقرارية هيستون ، ومقايسة السحب لأسفل لكشف تفاعلات هيستون تشابيرون هيستون ، والجامعة الأمريكية بالقاهرة لتحليل القياس المتكافئ لمجمعات البروتين ، ومقايسة مرافقة هيستون لتوصيف وظيفيا لمرافقة هيستون مفترضة في المختبر.

Abstract

ترتبط بروتينات الهستون بالحمض النووي (DNA) لتكوين الكروماتين حقيقي النواة. الوحدة الأساسية للكروماتين هي نيوكليوسوم ، يتكون من ثماني هيستون يتكون من نسختين من الهستونات الأساسية H2A و H2B و H3 و H4 ، ملفوفة حول الحمض النووي. يتكون الأوكتامير من نسختين من ثنائي H2A / H2B ونسخة واحدة من رباعي H3 / H4. الهستونات الأساسية عالية الشحنة عرضة لتفاعلات غير محددة مع العديد من البروتينات في السيتوبلازم الخلوي والنواة. تشكل مرافقات هيستون فئة متنوعة من البروتينات التي تنقل الهستونات من السيتوبلازم إلى النواة وتساعد على ترسبها على الحمض النووي ، وبالتالي تساعد في عملية تجميع النيوكليوسوم. بعض مرافقي هيستون محددون إما ل H2A / H2B أو H3 / H4 ، وبعضها يعمل كمرافقين لكليهما. يصف هذا البروتوكول كيف يمكن استخدام التقنيات المختبرية في المختبر مثل المقايسات المنسدلة ، وكروماتوغرافيا استبعاد الحجم التحليلية ، والطرد المركزي التحليلي الفائق ، ومقايسة مرافقة هيستون جنبا إلى جنب لتأكيد ما إذا كان بروتين معين يعمل كمرافق هيستون.

Introduction

تشكل النيوكليوسومات المكونة من الحمض النووي وبروتينات هيستون الوحدة الهيكلية للكروماتين وتنظم العديد من الأحداث الخلوية الحرجة. يتم تغيير موضع النيوكليوسومات ديناميكيا وإعادة تشكيلها لجعل الحمض النووي في متناول العمليات المختلفة مثل النسخ المتماثل والنسخ والترجمة 1,2. الهستونات الأساسية للغاية إما تميل إلى التفاعل مع البروتينات الحمضية في الوسط الخلوي أو تخضع للتجميع ، مما يؤدي إلى عيوب خلوية مختلفة3،4،5. تساعد مجموعة من البروتينات المخصصة تسمى مرافقو هيستون في نقل الهستونات من السيتوبلازم إلى النواة ومنع أحداث تجميع الحمض النووي الهستون الشاذة 6,7. بشكل أساسي ، تقوم معظم مرافقات الهستون بتخزين ونقل الهستونات إلى الحمض النووي بالقوة الأيونية الفسيولوجية ، مما يساعد على تكوين النيوكليوسومات 8,9. بعض مرافقي هيستون لديهم تفضيل واضح لأوليغومرات هيستون H2A / H2B أو H3 / H410.

تتميز مرافقات هيستون بناء على قدرتها على تجميع النيوكليوسومات المعتمدة أو المستقلة عن تخليق الحمض النووي11. على سبيل المثال ، يعتمد عامل تجميع الكروماتين -1 (CAF-1) بينما منظم هيستون A (HIRA) مستقل عن تخليق الحمض النووي12,13. وبالمثل ، تشارك عائلة النيوكليوبلازمين من مرافقي هيستون في تكثيف كروماتين الحيوانات المنوية وتجميع النيوكليوسوم14. يسهل أفراد عائلة بروتين تجميع النيوكليوسوم (NAP) تكوين هياكل تشبه النيوكليوسوم في المختبر ويشاركون في نقل الهستونات بين السيتوبلازم والنواة15. تعتبر كل من بروتينات عائلة النيوكليوبلازمين وبروتينات عائلة NAP مرافقين هيستون وظيفيين ولكنهما لا يشتركان في أي ميزات هيكلية. بشكل أساسي ، لا توجد ميزة هيكلية واحدة تسمح بتصنيف البروتين على أنه مرافقة هيستون16. يعمل استخدام المقايسات الوظيفية والفيزيائية الحيوية جنبا إلى جنب مع الدراسات الهيكلية بشكل أفضل في توصيف مرافقي الهستون.

يصف هذا العمل الطرق البيوكيميائية والفيزيائية الحيوية لتوصيف البروتين على أنه مرافقة هيستون تساعد على تجميع النيوكليوسوم. أولا ، تم إجراء كروماتوغرافيا استبعاد الحجم التحليلي لتحليل حالة قلة القسيمات واستقرار مرافقي هيستون. بعد ذلك ، تم إجراء اختبار منسدل لتحديد القوى الدافعة والطبيعة التنافسية لتفاعلات هيستون المرافقة والهيستون. ومع ذلك ، لا يمكن حساب المعلمات الهيدروديناميكية لهذه التفاعلات بدقة باستخدام كروماتوغرافيا استبعاد الحجم التحليلية بسبب شكل البروتين ومعقداته التي تؤثر على هجرتها عبر العمود. لذلك ، تم استخدام الطرد المركزي التحليلي الفائق ، والذي يوفر خصائص جزيئية كبيرة في المحلول تشمل الوزن الجزيئي الدقيق ، والقياس المتكافئ للتفاعل ، وشكل الجزيئات البيولوجية. استخدمت الدراسات السابقة على نطاق واسع مقايسة مرافقة هيستون في المختبر لتوصيف مرافقي هيستون وظيفيا مثل yScS116 17 و DmACF18 و ScRTT106p19 و HsNPM120. كما تم استخدام مقايسة مرافقة هيستون لتوصيف البروتينات وظيفيا على أنها مرافقة هيستون.

Protocol

1. كروماتوغرافيا استبعاد الحجم التحليلي لتوضيح الحالة قليلة القسيمات واستقرار مرافقي هيستون تحليل الحالة قليلة القسيمات لمرافقي هيستونموازنة عمود كروماتوغرافيا استبعاد الحجم التحليلي (SEC) سعة 24 مل مع حجم عمود 1.2 (CV)، أي 28.8 مل من المخزن المؤقت SEC المنزوع الغازات [20 mM من Tris-…

Representative Results

تعرض مجال نيوكليوبلازمين N-terminal المؤتلف للبروتين FKBP53 من Arabidopsis thaliana ل SEC التحليلي. تم رسم حجم ذروة الشطف مقابل المنحنى القياسي لتحديد حالته قليلة القسيمة. كشفت نتائج SEC التحليلية أن المجال موجود كمحلول خماسي ، بكتلة جزيئية تقريبية تبلغ 58 كيلو دالتون (الشكل 1 أ ، ب</stro…

Discussion

يوضح هذا العمل ويتحقق من صحة مجموعة شاملة من البروتوكولات للتوصيف البيوكيميائي والبيوفيزيائي لمرافق هيستون المفترض. هنا ، تم استخدام بروتينات عائلة NAP المعبر عنها والمنقاة ، AtNRP1 و AtNRP2 ، ومجال بلازما النواة N-terminal ل AtFKBP53 لإظهار البروتوكولات. يمكن استخدام نفس المجموعة من التجارب لتحديد الس?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

المنح الخارجية لديليب فاسوديفان من مجلس أبحاث العلوم والهندسة ، حكومة الهند [CRG / 2018 / 000695 / PS] وإدارة التكنولوجيا الحيوية ، وزارة العلوم والتكنولوجيا ، حكومة الهند [BT / INF / 22 / SP33046 / 2019] ، بالإضافة إلى الدعم الداخلي من معهد علوم الحياة ، بوبانسوار معترف بها إلى حد كبير. نشكر السيدة سوديشنا سين والسيدة أنابورنا ساهو على مساعدتهما في إعداد الهيستون. كما نعرب عن تقديرنا للمناقشات مع زملائنا الدكتور تشينمايي موهاباترا والسيد ماناس كومار جاغديف والدكتور شيخ نوساد حسين.

Materials

Acetic acid (glacial) Sigma A6283
Acrylamide MP Biomedicals 814326
Agarose MP Biomedicals 193983
AKTA Pure 25M FPLC Cytiva 29018226 Instrument for protein purification
Ammonium persulfate (APS) Sigma A3678
An-60Ti rotor Beckman Coulter 361964 Rotor for analytical ultracentrifugation
Bovine serum albumin (BSA) Sigma A7030
Chloroform Sigma C2432
Coomassie brilliant blue R 250 Sigma 1.15444
Dialysis tubing (7 kDa cut-off) Thermo Fisher 68700 For dialysing protein samples
Dithiothreitol (DTT) MP Biomedicals 100597
DNA Loading Dye New England Biolabs B7025S
EDTA disodium salt MP Biomedicals 194822
Electronic balance Shimadzu ATX224R
Ethanol Sigma E7023
Ethidium bromide (EtBr) Sigma E8751
Gel Doc System Bio-Rad 12009077 For imaging gels after staining
Horizontal gel electrophoresis apparatus Bio-Rad 1704405 Instrument for agarose gel electrophoresis
Hydrochloric acid (HCl) Sigma 320331
Imidazole MP Biomedicals 102033
Magnesium chloride (MgCl2) Sigma M8266
Micropipettes Eppendorf Z683779 For pipetting of micro-volumes
Mini-PROTEAN electrophoresis system Bio-Rad 1658000 Instrument for SDS-PAGE
N,N-methylene-bis-acrylamide MP Biomedicals 800172
Nano drop Thermo Fisher ND-2000 For measurement of protein and DNA concentrations
Ni-NTA agarose Invitrogen R901-15 Resin beads for pull-down assay
Optima AUC analytical ultracentrifuge Beckman Coulter B86437 Instrument for analytical ultracentrifugation
pH Meter Mettler Toledo MT30130863
Phenol Sigma P4557
Plasmid isolation kit Qiagen 27104
Proteinase K Sigma-Aldrich 1.07393
pUC19 Thermo Fisher SD0061 Plasmid for supercoiling assay
Refrigerated high-speed centrifuge Thermo Fisher 75002402
SDS-PAGE protein marker Bio-Rad 1610317
SEDFIT Free software program for analytical ultracentrifugation data analysis
SEDNTERP Free software program to estimate viscosity and density of buffer and partial specific volume of a protein
SigmaPrep Spin Columns Sigma SC1000 For pull-down assay
Sodium acetate Sigma S2889
Sodium chloride (NaCl) Merck S9888
Sodium dodecyl sulfate (SDS) MP Biomedicals 102918
Superdex 200 Increase 10/300 GL Cytiva 28990944 Column for analytical size-exclusion chromatography
Superdex 75 Increase 10/300 GL Cytiva 29148721 Column for analytical size-exclusion chromatography
TEMED Sigma 1.10732
Topoisomerase I Inspiralis WGT102 Enzyme used in plasmid supercoiling assay
Tris base Merck T1503
Tween-20 Sigma P1379
Urea MP Biomedicals 191450
Water bath Nüve NB 5 For heat treatment of protein samples
β-mercaptoethanol (β-ME) Sigma M6250
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Hübner, M. R., Eckersley-Maslin, M. A., Spector, D. L. Chromatin organization and transcriptional regulation. Current Opinion in Genetics and Development. 23 (2), 89-95 (2013).
  2. Lai, W. K. M., Pugh, B. F. Understanding nucleosome dynamics and their links to gene expression and DNA replication. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (9), 548-562 (2017).
  3. Kim, U. J., Han, M., Kayne, P., Grunstein, M. Effects of histone H4 depletion on the cell cycle and transcription of Saccharomyces cerevisiae. EMBO Journal. 7 (7), 2211-2219 (1988).
  4. Prado, F., Aguilera, A. Partial depletion of histone H4 increases homologous recombination-mediated genetic instability. Molecular and Cellular Biology. 25 (4), 1526-1536 (2005).
  5. Meeks-Wagner, D., Hartwell, L. H. Normal stoichiometry of histone dimer sets is necessary for high fidelity of mitotic chromosome transmission. Cell. 44 (1), 43-52 (1986).
  6. Groth, A., et al. Human Asf1 regulates the flow of S phase histones during replicational stress. Molecular Cell. 17 (2), 301-311 (2005).
  7. Laskey, R. A., Honda, B. M., Mills, A. D., Finch, J. T. Nucleosomes are assembled by an acidic protein which binds histones and transfers them to DNA. Nature. 275 (5679), 416-420 (1978).
  8. Das, C., Tyler, J. K., Churchill, M. E. A. The histone shuffle: histone chaperones in an energetic dance. Trends in Biochemical Sciences. 35 (9), 476-489 (2010).
  9. Akey, C. W., Luger, K. Histone chaperones and nucleosome assembly. Current Opinion in Structural Biology. 13 (1), 6-14 (2003).
  10. De Koning, L., Corpet, A., Haber, J. E., Almouzni, G. Histone chaperones: An escort network regulating histone traffic. Nature Structural and Molecular Biology. 14 (11), 997-1007 (2007).
  11. Eitoku, M., Sato, L., Senda, T., Horikoshi, M. Histone chaperones: 30 years from isolation to elucidation of the mechanisms of nucleosome assembly and disassembly. Cellular and Molecular Life Sciences. 65 (3), 414-444 (2008).
  12. Quivy, J. P., Grandi, P., Almouzni, G. Dimerization of the largest subunit of chromatin assembly factor 1: importance in vitro and during Xenopus early development. EMBO Journal. 20 (8), 2015-2027 (2001).
  13. Ray-Gallet, D., et al. HIRA is critical for a nucleosome assembly pathway independent of DNA synthesis. Molecular Cell. 9 (5), 1091-1100 (2002).
  14. Frehlick, L. J., Eirín-López, J. M., Ausió, J. New insights into the nucleophosmin/nucleoplasmin family of nuclear chaperones. Bioessays. 29 (1), 49-59 (2007).
  15. Ito, T., Bulger, M., Kobayashi, R., Kadonaga, J. T. Drosophila NAP-1 is a core histone chaperone that functions in ATP-facilitated assembly of regularly spaced nucleosomal arrays. Molecular and Cellular Biology. 16 (6), 3112-3124 (1996).
  16. Elsässer, S. J., D’Arcy, S. Towards a mechanism for histone chaperones. Biochimica et Biophysica Acta. 1819 (3-4), 211-221 (2013).
  17. Rodríguez-Campos, A., Koop, R., Faraudo, S., Beato, M. Transcriptionally competent chromatin assembled with exogenous histones in a yeast whole cell extract. Nucleic Acids Research. 32 (13), 111 (2004).
  18. Levenstein, M. E., Kadonaga, J. T. Biochemical analysis of chromatin containing recombinant Drosophila core histones. Journal of Biological Chemistry. 277 (10), 8749-8754 (2002).
  19. Huang, S., et al. Rtt106p is a histone chaperone involved in heterochromatin-mediated silencing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (38), 13410-13415 (2005).
  20. Swaminathan, V., Kishore, A. H., Febitha, K. K., Kundu, T. K. Human histone chaperone nucleophosmin enhances acetylation-dependent chromatin transcription. Molecular and Cellular Biology. 25 (17), 7534-7545 (2005).
  21. Singh, A. K., Datta, A., Jobichen, C., Luan, S., Vasudevan, D. AtFKBP53: A chimeric histone chaperone with functional nucleoplasmin and PPIase domains. Nucleic Acids Research. 48 (3), 1531-1550 (2020).
  22. Scofield, B. T. K. H. . Protein Electrophoresis. , (2012).
  23. Andrew, S. M., Titus, J. A., Zumstein, L. Dialysis and concentration of protein solutions. Current Protocols in Toxicology, Appendix 3. , 1-5 (2002).
  24. Balbo, A., Zhao, H., Brown, P. H., Schuck, P. Assembly, loading, and alignment of an analytical ultracentrifuge sample cell. Journal of Visualized Experiments. (33), e1530 (2009).
  25. Padavannil, A., Brautigam, C. A., Chook, Y. M. Molecular size analysis of recombinant importin-histone complexes using analytical ultracentrifugation. Bio-protocol. 10 (10), 3625 (2019).
  26. Zhao, H., Brautigam, C. A., Ghirlando, R., Schuck, P. Overview of current methods in sedimentation velocity and sedimentation equilibrium analytical ultracentrifugation. Current Protocols in Protein Science. , (2013).
  27. Schuck, P. Size-distribution analysis of macromolecules by sedimentation velocity ultracentrifugation and Lamm equation modelling. Biophysical Journal. 78 (3), 1606-1619 (2000).
  28. Kumar, A., Kumar Singh, A., Chandrakant Bob de, R., Vasudevan, D. Structural characterization of Arabidopsis thaliana NAP1-related protein 2 (AtNRP2) and comparison with its homolog AtNRP1. Molecules. 24 (12), 2258 (2019).
  29. Liu, W. H., Roemer, S. C., Port, A. M., Churchill, M. E. A. CAF-1-induced oligomerization of histones H3/H4 and mutually exclusive interactions with Asf1 guide H3/H4 transitions among histone chaperones and DNA. Nucleic Acids Research. 45 (16), 9809 (2017).
  30. Bowman, A., et al. The histone chaperones Vps75 and Nap1 form ring-like, tetrameric structures in solution. Nucleic Acids Research. 42 (9), 6038-6051 (2014).
  31. Newman, E. R., et al. Large multimeric assemblies of nucleosome assembly protein and histones revealed by small-angle X-ray scattering and electron microscopy. Journal of Biological Chemistry. 287 (32), 26657-26665 (2012).
  32. Edlich-Muth, C., et al. The pentameric nucleoplasmin fold is present in Drosophila FKBP39 and a large number of chromatin-related proteins. Journal of Molecular Biology. 427 (10), 1949-1963 (2015).
  33. Franco, A., et al. Structural insights into the ability of nucleoplasmin to assemble and chaperone histone octamers for DNA deposition. Scientific Reports. 9 (1), 9487 (2019).
  34. Xiao, H., Jackson, V., Lei, M. The FK506-binding protein, Fpr4, is an acidic histone chaperone. FEBS Letters. 580 (18), 4357-4364 (2006).
  35. Graziano, G. Role of hydrophobic effect in the salt-induced dimerization of bovine beta-lactoglobulin at pH 3. Biopolymers. 91 (12), 1182-1188 (2009).
  36. Burgess, R. J., Zhang, Z. Histone chaperones in nucleosome assembly and human disease. Nature Structural and Molecular Biology. 20 (1), 14-22 (2013).
  37. Donham, D. C., Scorgie, J. K., Churchill, M. E. The activity of the histone chaperone yeast Asf1 in the assembly and disassembly of histone H3/H4-DNA complexes. Nucleic Acids Research. 39 (13), 5449-5458 (2011).
  38. Avvakumov, N., Nourani, A., Côté, J. Histone chaperones: Modulators of chromatin marks. Molecular Cell. 41 (5), 502-514 (2011).
  39. Ransom, M., Dennehey, B. K., Tyler, J. K. Chaperoning histones during DNA replication and repair. Cell. 140 (2), 183-195 (2010).
  40. Chu, X., et al. Importance of electrostatic interactions in the association of intrinsically disordered histone chaperone Chz1 and histone H2A.Z-H2B. PLoS Computational Biology. 8 (7), 1002608 (2012).
  41. Heidarsson, P. O., et al. Disordered proteins enable histone chaperoning on the nucleosome. bioRxiv. , (2020).

Tags

Keywords: Histone ChaperonesPull-down AssaysAnalytical Size Exclusion ChromatographyAnalytical Ultra-centrifugationHistone Chaperoning AssayChromatin ResearchH2A/H2B DimerH3/H4 TetramerSDS-PAGECoomassie Brilliant Blue R250Dialysis BufferAnalytical Ultra Centrifuge
check_url/it/63218?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Bobde, R. C., Saharan, K., Baral, S., Gandhi, S., Samal, A., Sundaram, R., Kumar, A., Singh, A. K., Datta, A., Vasudevan, D. In Vitro Characterization of Histone Chaperones using Analytical, Pull-Down and Chaperoning Assays. J. Vis. Exp. (178), e63218, doi:10.3791/63218 (2021).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image