細菌の運動性における細菌の糖転移酵素の役割を解明するためのヌル変異体の生成
Summary
ここでは、特定の糖転移酵素または糖転移酵素を含む領域における アエロモナ スのヌル変異体の構築、グリカンの生合成におけるそれらのコードされた酵素の関与および機能を確立するために行われる運動性アッセイ、および鞭毛精製、ならびに細菌病因におけるこのグリカンの役割について説明する。
Abstract
原核生物におけるグリコシル化の研究は急速に成長している分野です。細菌は、その表面に異なるグリコシル化構造を有し、そのグリカンは株特異的バーコードを構成する。関連するグリカンは、真核生物のグリカンよりも糖組成および構造において高い多様性を示し、細菌宿主認識プロセスおよび環境との相互作用において重要である。病原性細菌では、糖タンパク質は感染プロセスのさまざまな段階に関与しており、糖鎖修飾は糖タンパク質の特定の機能を妨げる可能性がある。しかしながら、糖鎖の組成、構造、および生合成経路の理解においてなされた進歩にもかかわらず、病原性または環境との相互作用における糖タンパク質の役割の理解は非常に限られている。さらに、いくつかの細菌では、タンパク質グリコシル化に必要な酵素は、リポ多糖およびカプセル生合成経路などの他の多糖生合成経路と共有される。グリコシル化の機能的重要性は、グリコシル化プロセスに関与すると考えられる特定の遺伝子の変異と、それが標的糖タンパク質および修飾グリカンの発現に及ぼす影響の研究を通じて、いくつかの細菌において解明されてきた。中温性 アエロモナスは 、単一および O-グリコシル化極性鞭毛を有する。べん毛グリカンは、 アエロモナ ス株間の炭水化物組成および鎖長の多様性を示す。しかしながら、現在までに分析された全ての株は、セリンまたはスレオニン残基を修飾する連結糖としてプセウダミン酸誘導体を示す。プセウダミン酸誘導体は極性鞭毛集合に必要であり、その喪失は接着、バイオフィルム形成、およびコロニー形成に影響を与える。この記事で詳述するプロトコルは、鞭毛グリカンの生合成における推定糖転移酵素を含む遺伝子またはゲノム領域の関与を理解するために、ヌル変異体の構築をどのように使用できるかを説明しています。これには、関与する糖転移酵素の機能および糖鎖の役割を理解する可能性が含まれる。これは、グリカン欠損変異体を野生型株と比較することによって達成されるであろう。
Introduction
タンパク質グリコシル化は、グラム陽性およびグラム陰性細菌の両方において記載されており、アミノ酸側鎖1,2へのグリカンの共有結合からなる。原核生物では、このプロセスは、通常、2つの主要な酵素機構を介して起こる:O−およびN−グリコシル化3。O-グリコシル化において、グリカンはセリン(Ser)またはスレオニン(Thr)残基のヒドロキシル基に結合している。N-グリコシル化において、グリカンはトリペプチド配列Asn-X-Ser/Thr内のアスパラギン(Asn)残基の側鎖アミド窒素に結合し、Xはプロリンを除く任意のアミノ酸であり得る。
グリカンは、直鎖状または分枝鎖状の構造を採用することができ、グリコシド結合によって共有結合で結合された単糖または多糖類から構成される。原核生物において、グリカンは通常、真核生物グリカン4と比較して糖組成および構造において多様性を示す。さらに、グリカンが組み立てられ、アクセプタータンパク質に移される方法において異なる2つの異なる細菌グリコシル化経路が記載されている:逐次的および 一括 グリコシル化5、6。逐次グリコシル化の場合、複合糖鎖は、単糖の連続的な付加によってタンパク質上に直接構築される。 エンブロック グリコシル化では、予め組み立てられたグリカンが、特殊なオリゴサッカリルトランスフェラーゼ(OTase)によって脂質結合オリゴ糖からタンパク質に転移される。両方の経路が 、N− および O−グリコシル化プロセスに関与することが示されている7。
タンパク質のグリコシル化は、タンパク質の物理化学的および生物学的特性を調節する役割を有する。グリカンの存在は、タンパク質がそのリガンドとどのように相互作用するかに影響を与える可能性があり、これはタンパク質の生物学的活性に影響を与えるが、タンパク質の安定性、溶解性、タンパク質分解に対する感受性、免疫原性、および微生物と宿主の相互作用にも影響し得る8,9。しかし、グリカンの数、グリカン組成、位置、および結合機構などのいくつかのグリコシル化パラメータも、タンパク質の機能および構造に影響を及ぼす可能性がある。
糖転移酵素(GT)は、複合グリカンおよび複合糖質の生合成における重要な酵素である。これらの酵素は、活性化されたドナー分子からの糖部分と特定の基質アクセプターとの間のグリコシド結合形成を触媒する。GTsは、ドナー分子としてヌクレオチドおよび非ヌクレオチドの両方を使用し、タンパク質、糖類、核酸、および脂質などの異なる基質アクセプターを標的とすることができる10。したがって、GTを分子レベルで理解することは、その作用機序や特異性を解明するために重要であり、また、関連する分子を修飾する糖鎖の糖組成が病原性にどのように関連しているかを理解することを可能にする。炭水化物活性酵素データベース(CAZy)11は、GTを配列相同性に従って分類し、ほとんどのGTファミリーにおいて構造的フォールドおよび作用機序が不変であるため、予測ツールを提供する。しかしながら、多くのGTの基質特異性を予測することが困難な理由は、1)原核生物において基質特異性を決定する明確な配列モチーフが決定されていない、12)多くのGTおよびOTaseが基質混交性を示す13、14、3)機能的GTsが組換え形態で高収率で生産することが困難である、および4)ドナーおよびアクセプター基質の両方の同定が複雑である。それにもかかわらず、最近の突然変異誘発研究は、触媒機構の理解において著しい進歩を得て、GTの結合を差し引くことを可能にした。
細菌では、O-グリコシル化はN-グリコシル化よりも一般的であるようである。O-グリコシル化部位はコンセンサス配列を示さず、O–グリコシル化タンパク質の多くは、フラジェリン、ピリ、または自己輸送体などの分泌タンパク質または細胞表面タンパク質1である。クラジェリングリコシル化は、アクセプター部位の数、グリカン組成、および構造に変動性を示す。例えば、バークホルデリア属の鞭毛虫は1つのアクセプター部位しか持たないが、カンピロバクター・ジェジュニでは、鞭毛虫は19のアクセプター部位15,16個しか持たない。さらに、いくつかの細菌にとって、グリカンは単一の単糖であり、他の細菌はオリゴ糖を形成するために異なる単糖の妥協した不均一なグリカンを有する。この異原性は、同じ種の株間でも生じる。ヘリコバクター鞭毛虫はプセウダミン酸(PseAc)17によってのみ修飾され、カンピロバクター鞭毛虫はPseAc、プセウダミン酸(PseAm)またはレジオナミン酸(LegAm)のアセトアミジノ型、およびアセチル、N-アセチルグルコサミン、またはプロピオン置換18,19を有するこれらの糖に由来するグリカンによって修飾することができる。アエロモナスでは、鞭毛虫は、その組成が単一のPseAc酸誘導体からヘテロ多糖20までの範囲のグリカンによって修飾され、フラジェリンモノマーへのグリカンの結合は常にPseAc誘導体を介して行われる。
一般に、鞭毛虫のグリコシル化は、鞭毛フィラメントアセンブリ、運動性、ビルレンス、および宿主特異性に不可欠である。しかし、 C. jejuni16、 H. pylori17、 および Aeromonas sp.21は 、タンパク質モノマーがグリコシル化されない限り、フィラメントに組み立てることができない、 シュードモナス 属および バークホルデリア属。15は 鞭毛集合のためにグリコシル化を必要としない。さらに、いくつかの C. jejuni 株では、鞭毛グリカンの糖組成の変化が細菌−宿主相互作用に影響を及ぼし、特定の免疫応答を回避する上で役割を果たし得る16。自己凝集は、フラジェリンに関連するグリカンの組成における修飾によって影響を受ける別の表現型特性である。より低い自己凝集は、マイクロコロニーおよびバイオフィルム22を形成する能力の低下をもたらす。いくつかの細菌において、炎症促進反応を誘発する鞭毛の能力は、鞭毛グリコシル化と関連していた。したがって、 緑膿菌において、グリコシル化フラジェリンは、非グリコシル化23よりも高い炎症誘発性応答を誘導する。
アエロモナは、環境中に遍在するグラム陰性菌であり、これにより、それらがすべてのOne Health成分24の界面に存在することを可能にする。中温性アエロモナスは、恒常的に産生される単一の極性鞭毛を有する。臨床分離株の半分以上はまた、高粘度媒体またはプレート中で誘導可能な側方鞭毛を発現する。異なる研究は、両方の鞭毛タイプを細菌病因の初期段階と関連付けている25。現在までに報告された極性鞭毛は、その中心免疫原性ドメインの5〜8 SerまたはThr残基でO-グリコシル化されているが、側方鞭毛はすべての株においてO-グリコシル化されていない。異なる株由来の極性鞭毛グリカンはそれらの糖鎖組成および鎖長20において多様性を示すが、連結糖はプセウダミン酸誘導体であることが示された。
この原稿の目的は、GTを含む特定のGTまたは染色体領域におけるヌル変異体を取得し、関連する多糖類の生合成および細菌病原性におけるそれらの関与、ならびにグリカン自体の役割を分析する方法を説明することである。一例として、 アエロモナスの GTを含む染色体領域を同定・除去し、極性フラジェリングリコシル化への関与を確立し、フラジェリングリカンの役割を解析します。我々は、このグリカンの生合成におけるその機能を確立するために特定のGTを削除する方法と修飾グリカンの役割を示す。 アエロモナス を例にとりますが、この原理は、他のグラム陰性菌の鞭毛グリコシル化島を同定して研究し、O抗原リポ多糖などの他のグリカンの生合成に関与するGTの機能を分析するために使用できます。
Protocol
Representative Results
Discussion
この方法の重要な初期段階のステップは、鞭毛および推定GTのグリコシル化に関与する領域の同定であり、これらの酵素は高い相同性を示し、多くのプロセスに関与している。公開データベースにおける アエロモナ スゲノムのバイオインフォマティクス解析は、この領域が、多くの株のフラジェリン遺伝子を含み、プセウダミン酸の生合成に関与する遺伝子を含む極性鞭毛領域2に隣?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、カナダ国立研究評議会、プラン・ナシオナル・デ・イ・イ・コンペティティビダッド(スペイン、エコノミア・イ・コンペティビダド大臣)とカタルーニャ総局(Center de Referència en Biotecnologia)の支援を受けました。
Materials
| ABI PRISM Big Dye Terminator v. 3.1 Cycle Sequencing Ready Reaction Kit | Applied Biosystems | 4337455 | Used for sequencing |
| AccuPrime Taq DNA Polymerase, high fidelity | Invitrogen | 12346-086 | Used for amplification of AB, CD and AD fragments |
| Agarose | Conda-Pronadise | 8008 | Used for DNA electrophoresis |
| Alkaline phosphatase, calf intestinal (CIAP) | Promega | M1821 | Used to remove phosphate at the 5’ end |
| Bacto agar | Becton Dickinson | 214010 | Use for motility analysis |
| BamHI | Promega | R6021 | Used for endonuclease restriction |
| BglII | Promega | R6081 | Used for endonuclease restriction |
| BioDoc-It Imagin System | UVP | Bio-imaging station used for DNA visualization | |
| Biotaq polymerase | Bioline | BIO-21040 | Used for colony screening |
| Cesium chloride | Applichem | A1126,0100 | Used for flagella purification |
| Chloramphenicol | Applichem | A1806,0025 | Used for triparental mating |
| Cytiva illustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit | Cytivia | 28-9034-71 | Used for purification of PCR amplicons and DNA fragments. |
| EDTA | Applichem | 131026.1211 | Used for DNA electrophoresis |
| Electroporation cuvettes 2 mm gap | VWR | 732-1133 | Used for transformation |
| Ethidium bromide | Applichem | A1152,0025 | Use for DNA visualization |
| HyperLadder 1 Kb marker | Bioline | BIO-33053 | DNA marker |
| Invitrogen Easy-DNA gDNA Purification Kit | Invitrogen | 10750204 | Used for bacterial chromosomal DNA purification |
| Luria-Bertani (LB) Miller agar | Condalab | 996 | Used for Escherichia coli culture |
| Luria-Bertani (LB) Miller broth | Condalab | 1551 | Used for Escherichia coli culture |
| Nanodrop ND-1000 | NanoDrop Techonologies Inc | Spectrophotometer used for DNA quantification | |
| Rifampicin | Applichem | A2220,0005 | Used for triparental mating |
| SOC Medium | Invitrogen | 15544034 | Used for electroporation recovery |
| Spectinomycin | Applichem | A3834,0005 | Used for triparental mating |
| SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman | 331362 | Used for flagella purification |
| T4 DNA ligase | Invitrogen | 15224017 | Used for ligation reaction |
| Trypticasein soy agar | Condalab | 1068 | Used for Aeromonas grown |
| Trypticasein soy broth | Condalab | 1224 | Used for Aeromonas grown |
| Tryptone | Condalab | 1612 | Use for motility analysis |
| Tris | Applichem | A2264,0500 | Used for DNA electrophoresis and flagella purification |
| Triton X-100 | Applichem | A4975,0100 | Used for bacterial lysis |
| Ultra Clear tubes (14 mm x 89 mm) | Beckman | 344059 | Used for flagella purification |
| Veriti 96 well Thermal Cycler | Applied Biosystems | Used for PCR reactions | |
| Zyppy Plasmid Miniprep II Kit | Zymmo research | D4020 | Used for isolation of plasmid DNA |
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