박테리아 운동성에서 박테리아 글리코실트랜스퍼라제의 역할을 밝히기 위한 Null 돌연변이체의 생성
Summary
여기에서, 우리는 글리코실트랜스퍼라제를 함유하는 특정 글리코실트랜스퍼라제 또는 영역에서 에어로모나 스의 널 돌연변이체의 구축, 글리칸의 생합성에서 그들의 암호화된 효소의 관여 및 기능을 확립하기 위해 수행된 운동성 분석, 및 편모 정제, 뿐만 아니라 박테리아 병인에서 이러한 글리칸의 역할을 기술한다.
Abstract
원핵생물에서 글리코실화에 대한 연구는 빠르게 성장하는 영역이다. 박테리아는 표면에 다른 당화 된 구조를 가지고 있으며, 글리 칸은 균주 별 바코드를 구성합니다. 관련 글리 칸은 진핵 생물보다 설탕 조성과 구조에서 더 높은 다양성을 보여 주며 박테리아 – 숙주 인식 과정 및 환경과의 상호 작용에 중요합니다. 병원성 박테리아에서 당단백질은 감염 과정의 여러 단계에 관여했으며 글리 칸 변형은 당단백질의 특정 기능을 방해 할 수 있습니다. 그러나, 글리칸 조성, 구조 및 생합성 경로의 이해에서 이루어진 진보에도 불구하고, 병원성 또는 환경과의 상호작용에서 당단백질의 역할에 대한 이해는 매우 제한적이다. 또한, 일부 박테리아에서, 단백질 글리코실화에 필요한 효소는 리포폴리사카라이드 및 캡슐 생합성 경로와 같은 다른 다당류 생합성 경로와 공유된다. 글리코실화의 기능적 중요성은 글리코실화 과정에 관여하는 것으로 생각되는 특정 유전자의 돌연변이와 표적 당단백질 및 변형 글리칸의 발현에 미치는 영향에 대한 연구를 통해 여러 박테리아에서 해명되었다. 중온성 에어로모나스는 단일 및 O 글리코실화 극성 편모를 갖는다. 편모 글리 칸은 Aeromonas 균주 간의 탄수화물 구성과 사슬 길이의 다양성을 보여줍니다. 그러나, 현재까지 분석된 모든 균주는 세린 또는 트레오닌 잔기를 변형시키는 연결 당으로서 pseudaminic acid 유도체를 보여준다. pseudaminic acid 유도체는 극성 편모 조립에 필요하며 그 손실은 접착, 생물막 형성 및 식민지화에 영향을 미칩니다. 이 기사에 자세히 설명된 프로토콜은 편모 글리칸의 생합성에서 추정적 글리코실트랜스퍼라제를 함유하는 유전자 또는 게놈 영역의 관여를 이해하기 위해 널 돌연변이체의 구축이 어떻게 사용될 수 있는지를 기술한다. 여기에는 글리코실트랜스퍼라제의 기능 및 글리칸의 역할을 이해할 수 있는 잠재력이 포함된다. 이는 글리칸 결핍 돌연변이체를 야생형 균주와 비교함으로써 달성될 것이다.
Introduction
단백질 글리코실화는 그람 양성 및 그람 음성 박테리아 둘 다에 기술되어 있으며, 아미노산 측쇄 1,2에 대한 글리칸의 공유 부착으로 구성된다. 원핵생물에서, 이 과정은 보통 두 가지 주요 효소적 메카니즘을 통해 발생한다: O– 및 N-글리코실화3. O-글리코실화에서, 글리칸은 세린(Ser) 또는 트레오닌(Thr) 잔기의 히드록실기에 부착된다. N-글리코실화에서, 글리칸은 트리펩티드 서열 Asn-X-Ser/Thr 내의 아스파라긴(Asn) 잔기의 측쇄 아미드 질소에 부착되며, 여기서 X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산일 수 있다.
글리칸은 선형 또는 분지 구조를 채택 할 수 있으며 글리코시드 결합에 의해 공유적으로 연결된 단당류 또는 다당류로 구성됩니다. 원핵생물에서, 글리칸은 보통 진핵 글리칸4과 비교하여 설탕 조성 및 구조에서 다양성을 나타낸다. 더욱이, 글리칸이 조립되고 수용체 단백질로 전달되는 방법에 있어서 상이한 두 개의 상이한 박테리아 글리코실화 경로가 기술되었다: 순차적 및 엔블럭 글리코실화 5,6. 순차적 글리코실화를 위해, 복합 글리칸은 단당류의 연속적인 첨가에 의해 단백질 상에 직접 구축된다. 엔블럭 글리코실화에서, 미리 조립된 글리칸은 특수화된 올리고사카릴트랜스퍼라제(OTase)에 의해 지질-연결된 올리고당으로부터 단백질로 전사된다. 두 경로 모두 N– 및 O-글리코실화 과정7에 관여하는 것으로 나타났다.
단백질 글리코실화는 단백질의 물리화학적 및 생물학적 특성을 조절하는 역할을 한다. 글리칸의 존재는 단백질이 리간드와 상호 작용하는 방식에 영향을 미칠 수 있으며, 이는 단백질의 생물학적 활성에 영향을 미치지 만 단백질 안정성, 용해도, 단백질 분해에 대한 감수성, 면역원성 및 미생물 – 숙주 상호 작용 8,9에도 영향을 줄 수 있습니다. 그러나, 글리칸의 수, 글리칸 조성, 위치 및 부착 메카니즘과 같은 몇몇 글리코실화 파라미터는 또한 단백질 기능 및 구조에 영향을 미칠 수 있다.
글리코실트랜스퍼라제(GTs)는 복합 글리칸과 글리코컨쥬게이트의 생합성에 있어서 핵심 효소이다. 이들 효소는 활성화된 공여체 분자로부터의 당 모이어티와 특정 기질 수용체 사이의 글리코시드 결합 형성을 촉매한다. GTs는 공여체 분자로서 뉴클레오티드 및 비뉴클레오티드 둘 다를 사용할 수 있고, 단백질, 당류, 핵산 및 지질(10)과 같은 상이한 기질 수용체를 표적으로 할 수 있다. 따라서 분자 수준에서 GT를 이해하는 것은 작용 메커니즘과 특이성을 확인하는 데 중요하며 관련 분자를 변형시키는 글리 칸의 당 조성이 병원성과 어떻게 관련되어 있는지 이해할 수 있습니다. 탄수화물 활성 효소 데이터베이스 (CAZy)11은 GT를 서열 상동성에 따라 분류하며, 이는 대부분의 GT 패밀리에서 구조적 폴드 및 작용 메커니즘이 불변하기 때문에 예측 도구를 제공합니다. 그러나, 많은 GTs의 기질 특이성을 예측하기 어려운 네 가지 이유: 1) 원핵생물에서 기질 특이성을 결정하는 명확한 서열 모티프가 결정되지 않은12, 2) 많은 GTs 및 OTases는 기질 난잡함을 나타내고13,14, 3) 기능적 GTs는 재조합 형태로 고수율로 생산하기 어렵고 4) 공여체 및 수용체 기질 둘 다의 확인은 복잡하다. 그럼에도 불구하고, 최근의 돌연변이 유발 연구는 촉매 메커니즘의 이해와 GT의 뺄셈 결합에 상당한 진보를 얻는 것을 가능하게했다.
박테리아에서, O-글리코실화는 N-글리코실화보다 더 널리 퍼진 것으로 보인다. O-글리코실화 부위는 컨센서스 서열을 나타내지 않으며, 많은 O-글리코실화 단백질이 분비되거나 세포-표면 단백질, 예컨대 편모, 필리, 또는 자가수송체1. 편모 글리코실화는 수용체 부위의 수, 글리칸 조성, 및 구조에서 가변성을 나타낸다. 예를 들어, Burkholderia spp flagellins에는 하나의 수용체 사이트 만 있고 Campylobacter jejuni에서는 flagellins가 19 개의 수락자 사이트15,16을 가지고 있습니다. 또한, 일부 박테리아의 경우, 글리칸은 단일 단당류이며, 다른 박테리아는 올리고당을 형성하기 위해 다른 단당류로 손상된 이질적인 글리칸을 가지고 있습니다. 이러한 이질성은 동일한 종의 균주들 사이에서도 발생한다. 헬리코박터 편모는 pseudaminic acid (PseAc)17에 의해서만 변형되고, 캄필로박터 편모는 PseAc, 아세타미디노 형태의 pseudaminic acid (PseAm) 또는 레지오나민산 (LegAm)에 의해 변형될 수 있고, 이들 당으로부터 유래된 글리칸은 아세틸, N-아세틸글루코사민, 또는 프로피온성 치환18,19로 유도된다. Aeromonas에서 편모는 단일 PseAc 산 유도체에서 헤테로 다당류20에 이르는 조성의 글리 칸에 의해 변형되며 편모 단량체에 글리 칸을 부착하는 것은 항상 PseAc 유도체를 통해 이루어집니다.
일반적으로, 편모의 글리코실화는 편모 필라멘트 조립, 운동성, 독성, 및 숙주 특이성에 필수적이다. 그러나, C. jejuni16, H. pylori17 및 Aeromonas sp의 편모가 있는 동안. 도 21은 단백질 단량체가 글리코실화되지 않는 한 필라멘트로 조립할 수 없으며, 슈도모나스 spp. 및 Burkholderia spp. 도 15는 편모 조립을 위한 글리코실화를 필요로 하지 않는다. 더욱이, 일부 C. jejuni 균주에서, 편모 글리칸의 당 조성의 변화는 박테리아-숙주 상호작용에 영향을 미치고, 특정 면역 반응(16)을 회피하는 역할을 할 수 있다. 자가 응집은 편모와 관련된 글리 칸의 조성의 변형에 의해 영향을받는 또 다른 표현형 특성입니다. 더 낮은 자가응집은 마이크로콜로니 및 생물막(22)을 형성하는 능력의 감소를 유도한다. 일부 박테리아에서, 편모가 전염증 반응을 촉발시키는 능력은 편모 글리코실화와 관련이 있었다. 따라서, P. aeruginosa에서, 당화 편모는 당화되지 않은23보다 더 높은 전염증 반응을 유도한다.
에어로모나스는 그람 음성 박테리아로 환경에 유비쿼터스이며, 이는 모든 One Health 구성 요소(24)의 계면에 있을 수 있게 한다. 중온성 에어로모나스는 단일 극성 편모를 가지고 있으며, 이는 구성적으로 생산됩니다. 임상 단리물의 절반 이상은 또한 고점도 매질 또는 플레이트에서 유도성 측방향 편모를 발현한다. 다른 연구는 두 편모 유형을 박테리아 병인의 초기 단계와 관련시켰다25. 현재까지 보고된 극성 편모는 그의 중심 면역원성 도메인의 5-8 Ser 또는 Thr 잔기에서 O-글리코실화되는 반면, 측방 편모는 모든 균주에서 O-글리코실화되지 않는다. 상이한 균주로부터의 극성 편모 글리칸이 그들의 탄수화물 조성 및 사슬 길이20에서 다양성을 나타내지만, 연결 당은 pseudaminic acid 유도체인 것으로 나타났다.
이 원고의 목표는 GT를 포함하는 특정 GT 또는 염색체 영역에서 null 돌연변이를 얻는 방법을 설명하여 관련 다당류의 생합성 및 박테리아 병원성뿐만 아니라 글리칸 자체의 역할에 대한 관여를 분석하는 것입니다. 예를 들어, 우리는 극성 편모 글리코실화에 대한 관여를 확립하고 편모 글리칸의 역할을 분석하기 위해 Aeromonas 의 GT를 포함하는 염색체 영역을 확인하고 삭제합니다. 우리는이 글리 칸의 생합성과 변형 된 글리 칸의 역할에서 그 기능을 확립하기 위해 특정 GT를 삭제하는 방법을 보여줍니다. Aeromonas 를 예로 들자면, 이 원리는 다른 그람 음성 박테리아의 편모 글리코실화 섬을 확인 및 연구하고, O-항원 리포폴리사카라이드와 같은 다른 글리칸의 생합성에 관여하는 GT의 기능을 분석하는데 사용될 수 있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 방법의 중요한 초기 단계는 편모 및 추정 GT의 글리코실화에 관여하는 영역을 확인하는 것인데, 이는 이들 효소가 높은 상동성을 보이고 많은 과정에 관여하기 때문이다. 공공 데이터베이스에서 Aeromonas 게놈의 생물 정보학 분석은이 영역이 많은 균주의 편모 유전자를 포함하고 pseudaminic acid27의 생합성에 관여하는 유전자를 포함하는 극성 편모 영역 2에 인접 해 있음을 ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 캐나다 국립 연구위원회 (Plan Nacional de I + D) (Ministerio de Economía y Competitividad, Spain) 및 Generalitat de Catalunya (Centre de Referència en Biotecnologia)의 지원을 받았다.
Materials
| ABI PRISM Big Dye Terminator v. 3.1 Cycle Sequencing Ready Reaction Kit | Applied Biosystems | 4337455 | Used for sequencing |
| AccuPrime Taq DNA Polymerase, high fidelity | Invitrogen | 12346-086 | Used for amplification of AB, CD and AD fragments |
| Agarose | Conda-Pronadise | 8008 | Used for DNA electrophoresis |
| Alkaline phosphatase, calf intestinal (CIAP) | Promega | M1821 | Used to remove phosphate at the 5’ end |
| Bacto agar | Becton Dickinson | 214010 | Use for motility analysis |
| BamHI | Promega | R6021 | Used for endonuclease restriction |
| BglII | Promega | R6081 | Used for endonuclease restriction |
| BioDoc-It Imagin System | UVP | Bio-imaging station used for DNA visualization | |
| Biotaq polymerase | Bioline | BIO-21040 | Used for colony screening |
| Cesium chloride | Applichem | A1126,0100 | Used for flagella purification |
| Chloramphenicol | Applichem | A1806,0025 | Used for triparental mating |
| Cytiva illustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit | Cytivia | 28-9034-71 | Used for purification of PCR amplicons and DNA fragments. |
| EDTA | Applichem | 131026.1211 | Used for DNA electrophoresis |
| Electroporation cuvettes 2 mm gap | VWR | 732-1133 | Used for transformation |
| Ethidium bromide | Applichem | A1152,0025 | Use for DNA visualization |
| HyperLadder 1 Kb marker | Bioline | BIO-33053 | DNA marker |
| Invitrogen Easy-DNA gDNA Purification Kit | Invitrogen | 10750204 | Used for bacterial chromosomal DNA purification |
| Luria-Bertani (LB) Miller agar | Condalab | 996 | Used for Escherichia coli culture |
| Luria-Bertani (LB) Miller broth | Condalab | 1551 | Used for Escherichia coli culture |
| Nanodrop ND-1000 | NanoDrop Techonologies Inc | Spectrophotometer used for DNA quantification | |
| Rifampicin | Applichem | A2220,0005 | Used for triparental mating |
| SOC Medium | Invitrogen | 15544034 | Used for electroporation recovery |
| Spectinomycin | Applichem | A3834,0005 | Used for triparental mating |
| SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman | 331362 | Used for flagella purification |
| T4 DNA ligase | Invitrogen | 15224017 | Used for ligation reaction |
| Trypticasein soy agar | Condalab | 1068 | Used for Aeromonas grown |
| Trypticasein soy broth | Condalab | 1224 | Used for Aeromonas grown |
| Tryptone | Condalab | 1612 | Use for motility analysis |
| Tris | Applichem | A2264,0500 | Used for DNA electrophoresis and flagella purification |
| Triton X-100 | Applichem | A4975,0100 | Used for bacterial lysis |
| Ultra Clear tubes (14 mm x 89 mm) | Beckman | 344059 | Used for flagella purification |
| Veriti 96 well Thermal Cycler | Applied Biosystems | Used for PCR reactions | |
| Zyppy Plasmid Miniprep II Kit | Zymmo research | D4020 | Used for isolation of plasmid DNA |
Riferimenti
- Schäffer, C., Messner, P. Emerging facets of prokaryotic glycosylation. FEMS Microbiology Review. 41 (1), 49-91 (2017).
- De Maayer, P., Cowan, D. A. Flashy flagella: flagellin modification is relatively common and highly versatile among the Enterobacteriaceae. BMC Genomics. 17, 377 (2016).
- Nothaft, H., Szymanski, C. M. Protein glycosylation in bacteria: sweeter than ever. Nature Review Microbiology. 8 (11), 765-778 (2010).
- Benz, I., Schmidt, M. A. Never say never again: protein glycosylation in pathogenic bacteria. Molecular Microbiology. 45 (2), 267-276 (2002).
- Guerry, P., Szymanski, C. M. Campylobacter sugars sticking out. Trends in Microbiology. 16 (9), 428-435 (2008).
- Hug, I., Feldman, M. F. Analogies and homologies in lipopolysaccharide and glycoprotein biosynthesis in bacteria. Glycobiology. 21 (2), 138-151 (2011).
- Iwashkiw, J. A., Vozza, N. F., Kinsella, R. L., Feldman, M. F. Pour some sugar on it: the expanding world of bacterial protein O-linked glycosylation. Molecular Microbiology. 89 (1), 14-28 (2013).
- Szymanski, C. M., Wren, B. W. Protein glycosylation in bacterial mucosal pathogens. Nature Review Microbiology. 3, 225-237 (2005).
- Tan, F. Y. Y., Tang, C. M., Exley, R. M. Sugar coating: bacterial protein glycosylation and host-microbe interactions. Trends Biochemistry Sciences. 40 (7), 342-350 (2015).
- Lairson, L. L., Henrissat, B., Davies, G. J., Withers, S. G. Glycosyltransferases: structures, functions, and mechanisms. Annual Review Biochemistry. 77, 521-555 (2008).
- Lombard, V., Golaconda Ramulu, H., Drula, E., Coutinho, P. M., Henrissat, B. The carbohydrate-active enzymes database (CAZy) in 2013. Nucleic Acids Research. 42, 490-495 (2014).
- Weerapana, E., Imperiali, B. Asparagine-linked protein glycosylation: from eukaryotic to prokaryotic systems. Glycobiology. 16 (6), 91 (2006).
- Faridmoayer, A., et al. Extreme substrate promiscuity of the Neisseria oligosaccharyl transferase involved in protein O-glycosylation. Journal of Biological Chemistry. 283 (50), 34596-34604 (2008).
- Wacker, M., et al. Substrate specificity of bacterial oligosaccharyltransferase suggests a common transfer mechanism for the bacterial and eukaryotic systems. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (18), 7088-7093 (2006).
- Scott, A. E., et al. Flagellar glycosylation in Burkholderia pseudomallei and Burkholderia thailandensis. Journal of Bacteriology. 193 (14), 3577-3587 (2011).
- Thibault, P., et al. Identification of the carbohydrate moieties and glycosylation motifs in Campylobacter jejuni flagellin. Journal of Biological Chemistry. 276 (37), 34862-34870 (2001).
- Schirm, M., et al. Structural, genetic and functional characterization of the flagellin glycosylation process in Helicobacter pylori. Molecular Microbiology. 48 (6), 1579-1592 (2003).
- McNally, D. J., et al. Targeted metabolomics analysis of Campylobacter coli VC167 reveals legionaminic acid derivatives as novel flagellar glycans. Journal of Biological Chemistry. 282 (19), 14463-14475 (2007).
- Logan, S. M., et al. Identification of novel carbohydrate modifications on Campylobacter jejuni 11168 flagellin using metabolomics-based approaches. FEBS Journal. 276 (4), 1014-1023 (2009).
- Wilhelms, M., Fulton, K. M., Twine, S. M., Tomás, J. M., Merino, S. Differential glycosylation of polar and lateral flagellins in Aeromonas hydrophila AH-3. Journal of Biological Chemistry. 287 (33), 27851-27862 (2012).
- Canals, R., et al. Non-structural flagella genes affecting both polar and lateral flagella-mediated motility in Aeromonas hydrophila. Microbiology. 153, 1165-1175 (2007).
- Howard, S. L., et al. Campylobacter jejuni glycosylation island important in cell charge, legionaminic acid biosynthesis, and colonization of chickens. Infection and Immunity. 77 (6), 2544-2556 (2009).
- Verma, A., Arora, S. K., Kuravi, S. K., Ramphal, R. Roles of specific amino acids in the N-terminus of Pseudomonas aeruginosa flagellin and of flagellin glycosylation in the innate immune response. Infection and Immunity. 73 (12), 8237-8246 (2005).
- Lamy, B., Baron, S., Barraud, O. Aeromonas: the multifaceted middleman in the One Health world. Current Opinion in Microbiology. 65, 24-32 (2022).
- Gavín, R., et al. Lateral flagella of Aeromonas species are essential for epithelial cell adherence and biofilm formation. Molecular Microbiology. 43 (2), 383-397 (2002).
- Altschul, F. S., et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Research. 25 (17), 3389-3402 (1997).
- Forn-Cuní, G., et al. Polar flagella glycosylation in Aeromonas: Genomic characterization and Involvement of a specific glycosyltransferase (Fgi-1) in heterogeneous flagella glycosylation. Frontiers in Microbiology. 11, 595697 (2021).
- Milton, D. L., O’Toole, R., Horstedt, P., Wolf-Watz, H. Flagellin A is essential for the virulence of Vibrio anguillarum. Journal of Bacteriol.ogy. 178 (5), 1310-1319 (1996).
- Kovács, N. Identification of Pseudomonas pyocyanea by the oxidase reaction. Nature. 178 (4535), 703 (1956).
- Fulton, K. M., Mendoza-Barberá, E., Twine, S. M., Tomás, J. M., Merino, S. Polar glycosylated and lateral non-glycosylated flagella from Aeromonas hydrophila strain AH-1 (Serotype O11). International Journal of Molecular Sciences. 16 (12), 28255-28269 (2015).
- Khider, M., Willassen, N. P., Hansen, H. The alternative sigma factor RpoQ regulates colony morphology, biofilm formation and motility in the fish pathogen Aliivibrio salmonicida. BMC Microbiology. 18 (1), 116 (2018).
- Pawar, S. V., et al. Novel genetic tools to tackle c-di-GMP-dependent signalling in Pseudomonas aeruginosa. Journal of Applied Microbiology. 120 (1), 205-217 (2016).
- Vander Broek, W., Chalmers, K. J., Stevens, M. P., Stevens, J. M. Quantitative proteomic analysis of Burkholderia pseuomallei Bsa Type III secretion system effectors using hypersecreting mutants. The American Society for Biochemistry and Molecular Biology. 14 (4), 905-916 (2015).
