Geração de Mutantes Nulos para Elucidar o Papel das Glicosyltransferases Bacterianas na Motilidade Bacteriana

Summary

Aqui, descrevemos a construção de mutantes nulos de Aeromonas em glicosyltransferases específicas ou regiões contendo glicosyltransferases, os ensaios de motilidade e a purificação de flagela realizadas para estabelecer o envolvimento e função de suas enzimas codificadas na biossíntese de um glicano, bem como o papel deste glicano em patógenos bacterianos.

Abstract

O estudo da glicosylation em procariotes é uma área de rápido crescimento. As bactérias abrigam diferentes estruturas glicosylated em sua superfície cujos glicanos constituem um código de barras específico para a cepa. Os glicanos associados apresentam maior diversidade na composição e estrutura do açúcar do que os de eucariotes e são importantes nos processos de reconhecimento de hospedeiros bacterianos e na interação com o meio ambiente. Em bactérias patogênicas, as glicoproteínas estiveram envolvidas em diferentes estágios do processo infeccioso, e modificações glicais podem interferir com funções específicas de glicoproteínas. No entanto, apesar dos avanços na compreensão das vias de composição, estrutura e biossíntese glicano, a compreensão do papel das glicoproteínas na patogenicidade ou interação com o ambiente permanece muito limitada. Além disso, em algumas bactérias, as enzimas necessárias para a glicossiltação proteica são compartilhadas com outras vias biossintéticas de polissacarídeo, como lipopoliposcarídeos e vias biossintéticas de cápsulas. A importância funcional da glicossylation tem sido elucidada em várias bactérias através da mutação de genes específicos considerados envolvidos no processo de glicosylation e no estudo de seu impacto na expressão da glicoproteína alvo e da glican modificadora. Aeromonas mesofílicas têm um único e O-glycosylated flagellum polar. Os glicanos flageladores mostram diversidade na composição de carboidratos e comprimento da cadeia entre cepas de Aeromonas. No entanto, todas as cepas analisadas até o momento mostram um derivado de ácido pseudaminic como o açúcar de ligação que modifica resíduos de serina ou threonina. O derivado de ácido pseudaminico é necessário para a montagem de flagella polar, e sua perda tem um impacto na adesão, formação de biofilme e colonização. O protocolo detalhado neste artigo descreve como a construção de mutantes nulos pode ser usada para entender o envolvimento de genes ou regiões do genoma contendo glicosyltransferases putativas na biosíntese de um glicano flagelar. Isso inclui o potencial de compreender a função das glicosyltransferases envolvidas e o papel do glicano. Isso será alcançado comparando o mutante deficiente glicano com a cepa selvagem.

Introduction

A glicossylação proteica tem sido descrita em ambas as bactérias Gram-positivas e Gram-negativas e consiste no apego covalente de um glicano a uma cadeia lateral de aminoácidos ^1,2. Em procariotes, esse processo geralmente ocorre através de dois mecanismos enzimáticos principais: O- e N-glicosylation³. Na O-glicosylation, o glicano é anexado ao grupo hidroxyl de um resíduo serino (Ser) ou threonine (Thr). Na N-glicosylation, o glicano é anexado à cadeia lateral em meio a nitrogênio de um resíduo de asparagine (Asn) dentro das sequências de tripeptídeos Asn-X-Ser/Thr, onde X poderia ser qualquer aminoácido, exceto proline.

Os glicanos podem adotar estruturas lineares ou ramificadas e são compostos de monossacarídeos ou polissacarídeos covalentemente ligados por ligações glicossídicas. Em procariotes, os glicanos costumam mostrar diversidade na composição e estrutura do açúcar em comparação com os glicanos eucarióticos⁴. Além disso, duas diferentes vias de glicosylation bacteriana que diferem na forma como o glicano é montado e transferido para a proteína aceitadora foram descritas: glicossolation sequencial e en bloco ^5,6. Para a glicossicação sequencial, o glicano complexo é construído diretamente sobre a proteína por sucessivas adição de monossacarídeos. Na glicosylation en bloc, um glicano pré-montado é transferido para a proteína a partir de um oligossacarídeo ligado a lipídios por um oligossacaryltransferase especializado (OTase). Ambas as vias mostraram-se envolvidas nos processos de N e O-glicosylation 7.

A glicossomilation proteica tem um papel na modulação das propriedades físico-químicas e biológicas das proteínas. A presença de um glicano pode influenciar como a proteína interage com seu ligante, que afeta a atividade biológica da proteína, mas também pode afetar a estabilidade proteica, solubilidade, suscetibilidade à proteólise, imunogenicidade e interações micróbios^8,9. No entanto, vários parâmetros de glicosylation, como o número de glicanos, composição glica, posição e mecanismo de apego, também podem afetar a função e a estrutura da proteína.

As glicosilatransferases (GTs) são as enzimas-chave na biossíntese de glicanos complexos e glicoconjugados. Essas enzimas catalisam a formação de ligação glicósdica entre uma moiety de açúcar de uma molécula de doador ativada e um aceitador de substrato específico. Os GTs podem usar nucleotídeos e não-nucleotídeos como moléculas de doadores e atingir diferentes aceitadores de substratos, como proteínas, sacarídeos, ácidos nucleicos e lipídios¹⁰. Portanto, compreender os GTs no nível molecular é importante para identificar seus mecanismos de ação e especificidade, e também permite entender como a composição do açúcar dos glicanos que modificam moléculas relevantes está relacionada à patogenicidade. O banco de dados de enzimas enzimásis Ativos de Carboidratos (CAZy)¹¹ classifica os GTs de acordo com sua sequência de homologia, que fornece uma ferramenta preditiva, uma vez que, na maioria das famílias GT, a dobra estrutural e os mecanismos de ação são invariantes. No entanto, quatro razões dificultam a previsão da especificidade do substrato de muitos GTs: 1) nenhum motivo de sequência clara determinando a especificidade do substrato foi determinado nos procariotes¹², 2) muitos GTs e OTases mostram promiscuidade de substrato ^13,14, 3) GTs funcionais são difíceis de produzir em alto rendimento em forma recombinante e 4) a identificação de substratos doadores e aceitadores é complexa. Apesar disso, estudos recentes de mutagênese permitiram obter avanços significativos na compreensão de mecanismos catalíticos e subtrair a vinculação dos GTs.

Em bactérias, o-glicosylation parece ser mais prevalente do que n-glicosylation. Os locais de o-glicosylation não mostram uma sequência de consenso, e muitas das proteínas O-glicosylated são secretas ou proteínas de superfície celular, como flagellins, pili ou autotransportadores¹. A glicossylation flagellin mostra variabilidade no número de locais de aceitação, composição glica e estrutura. Por exemplo, burkholderia spp flagellins têm apenas um site de aceitação, enquanto em Campylobacter jejuni, flagellins têm até 19 locais de aceitação^15,16. Além disso, para algumas bactérias, o glicano é um único monossacarídeo, enquanto outras bactérias possuem glicanos heterogêneos comprometidos de diferentes monossacarídeos para formar oligossacarídeos. Essa heterogenicidade ocorre mesmo entre cepas da mesma espécie. As flagellins helicobacter só são modificadas por ácido pseudaminic (PseAc)¹⁷, e as flagellins campylobacter podem ser modificadas por PseAc, a forma acetamidino do ácido pseudaminico (PseAm) ou ácido legionamínico (LegAm), e glycans derivados desses açúcares com acetil, N-acetilglucosamina, ou substituições propiônicas ^18,19. Em Aeromonas, as flagellins são modificadas por glicanos cuja composição varia de um único derivado ácido PseAc a um heteropolysacarídeo²⁰, e o apego dos glicanos aos monômeros flagellin é sempre através de um derivado PseAc.

Em geral, a glicossylation de flagellins é essencial para a montagem de filamento flagelar, motilidade, virulência e especificidade do hospedeiro. No entanto, enquanto flagellins de C. jejuni¹⁶, H. pylori^17, e Aeromonas sp. ²¹ não pode se montar em filamentos a menos que os monômeros proteicos sejam glicosiltos, Pseudomonas spp. e Burkholderia spp. ¹⁵ não requerem glicossylation para montagem flagela. Além disso, em algumas cepas de C. jejuni , alterações na composição do açúcar da flagelaglicano podem afetar a interação bacteriana-hospedeira e podem desempenhar um papel na fuga de certas respostas imunes¹⁶. A autoaglictinação é outra característica fenotípica afetada por modificações na composição de glicanos associados a flagellins. Uma autoagglutinação mais baixa leva a uma redução na capacidade de formar microcolônias e biofilme²². Em algumas bactérias, a capacidade de flagela para desencadear uma resposta pró-inflamatória estava ligada à glicoslação flagellina. Assim, em P. aeruginosa, o flagellin glicosilado induz uma resposta pró-inflamatória maior do que o ungcosylated²³.

Aeromonas são bactérias Gram-negativas onipresentes no ambiente, o que permite que elas estejam na interface de todos os componentes do One Health ²⁴. Aeromonas mesofílicas têm um único flagelo polar, que é produzido constitutivamente. Mais da metade dos isolados clínicos também expressam flagellin lateral, indutível em mídia ou placas de alta viscosidade. Diferentes estudos relacionaram ambos os tipos de flagela com os estágios iniciais da patogênese bacteriana²⁵. Enquanto as bandeiras polares relatadas até o momento são O-glycosylated em 5-8 Resíduos de Ser ou Thr de seus domínios imunológicos centrais, flagellins laterais não são O-glycosylated em todas as cepas. Embora as glicans flagella polares de diferentes cepas mostrem diversidade em sua composição de carboidratos e comprimento da cadeia²⁰, o açúcar de ligação tem se mostrado um derivado de ácido pseudaminic.

O objetivo deste manuscrito é descrever um método para obter mutantes nulos em GTs específicos ou regiões cromossômicas contendo GTs para analisar seu envolvimento na biossíntese de polissacarídeos relevantes e na patogenicidade bacteriana, bem como o papel do próprio glicano. Como exemplo, identificamos e excluímos uma região cromossômica contendo GTs de Aeromonas para estabelecer seu envolvimento na glicosilação de bandeira polar e analisar o papel do glicano flagellin. Mostramos como excluir um GT específico para estabelecer sua função na biosíntese deste glicano e o papel do glicano modificado. Embora usando Aeromonas como exemplo, o princípio pode ser usado para identificar e estudar ilhas de glicosilação flagella de outras bactérias Gram-negativas e analisar a função de GTs envolvidos na biosíntese de outros glicanos, como o lipopólio-de-o-antígeno.

Protocol

A representação esquemática do procedimento é mostrada na Figura 1. 1. Identificação bioinformática da ilha flagella glicosylation (FGIs) em Aeromonas Para identificar os clusters biossintéticos PseAc nos genomas de Aeromonas , use a ferramenta tblastn do banco de dados NCBI26. Primeiro, recupere proteínas ortologos para PseC e PseI de A. piscicola AH-3 (códigos de ide…

Representative Results

Esta metodologia fornece um sistema eficaz para gerar mutantes nulos em genes ou regiões cromossômicas de Aeromonas que podem afetar a glicosylation flagella e o papel do filamento flagela (Figura 1). O protocolo começa com a identificação bioinformática dos FGIs putativos e os genes que codificam os GTs presentes nesta região. Em Aeromonas, a localização cromossômica dos FGIs baseia-se na detecção de três tipos de genes: genes envol…

Discussion

O passo crítico inicial desse método é a identificação de regiões envolvidas na glicosilação de flagela e GTs putativas porque essas enzimas apresentam alta homologia e estão envolvidas em muitos processos. A análise bioinformática dos genomas de Aeromonas em bancos de dados públicos mostra que esta região é adjacente à região de flagela polar 2, que contém os genes flagellin em muitas cepas e contém genes envolvidos na biosíntese do ácido udaminic²⁷. Isso possibilitou…

Materials

ABI PRISM Big Dye Terminator v. 3.1 Cycle Sequencing Ready Reaction Kit	Applied Biosystems	4337455	Used for sequencing
AccuPrime Taq DNA Polymerase, high fidelity	Invitrogen	12346-086	Used for amplification of AB, CD and AD fragments
Agarose	Conda-Pronadise	8008	Used for DNA electrophoresis
Alkaline phosphatase, calf intestinal (CIAP)	Promega	M1821	Used to remove phosphate at the 5’ end
Bacto agar	Becton Dickinson	214010	Use for motility analysis
BamHI	Promega	R6021	Used for endonuclease restriction
BglII	Promega	R6081	Used for endonuclease restriction
BioDoc-It Imagin System	UVP		Bio-imaging station used for DNA visualization
Biotaq polymerase	Bioline	BIO-21040	Used for colony screening
Cesium chloride	Applichem	A1126,0100	Used for flagella purification
Chloramphenicol	Applichem	A1806,0025	Used for triparental mating
Cytiva illustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit	Cytivia	28-9034-71	Used for purification of PCR amplicons and DNA fragments.
EDTA	Applichem	131026.1211	Used for DNA electrophoresis
Electroporation cuvettes 2 mm gap	VWR	732-1133	Used for transformation
Ethidium bromide	Applichem	A1152,0025	Use for DNA visualization
HyperLadder 1 Kb marker	Bioline	BIO-33053	DNA marker
Invitrogen Easy-DNA gDNA Purification Kit	Invitrogen	10750204	Used for bacterial chromosomal DNA purification
Luria-Bertani (LB) Miller agar	Condalab	996	Used for Escherichia coli culture
Luria-Bertani (LB) Miller broth	Condalab	1551	Used for Escherichia coli culture
Nanodrop ND-1000	NanoDrop Techonologies Inc		Spectrophotometer used for DNA quantification
Rifampicin	Applichem	A2220,0005	Used for triparental mating
SOC Medium	Invitrogen	15544034	Used for electroporation recovery
Spectinomycin	Applichem	A3834,0005	Used for triparental mating
SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor	Beckman	331362	Used for flagella purification
T4 DNA ligase	Invitrogen	15224017	Used for ligation reaction
Trypticasein soy agar	Condalab	1068	Used for Aeromonas grown
Trypticasein soy broth	Condalab	1224	Used for Aeromonas grown
Tryptone	Condalab	1612	Use for motility analysis
Tris	Applichem	A2264,0500	Used for DNA electrophoresis and flagella purification
Triton X-100	Applichem	A4975,0100	Used for bacterial lysis
Ultra Clear tubes (14 mm x 89 mm)	Beckman	344059	Used for flagella purification
Veriti 96 well Thermal Cycler	Applied Biosystems		Used for PCR reactions
Zyppy Plasmid Miniprep II Kit	Zymmo research	D4020	Used for isolation of plasmid DNA