Генерация нулевых мутантов для выяснения роли бактериальных гликозилтрансфераз в бактериальной подвижности
Summary
Здесь мы опишем построение нулевых мутантов Aeromonas в специфических гликозилтрансферазах или областях, содержащих гликозилтрансферазы, анализы подвижности и очистку жгутиков, выполненные для установления участия и функции их кодируемых ферментов в биосинтезе гликана, а также роль этого гликана в бактериальном патогенезе.
Abstract
Изучение гликозилирования у прокариот является быстро растущей областью. Бактерии содержат различные гликозилированные структуры на своей поверхности, гликаны которых составляют специфический для штамма штрих-код. Ассоциированные гликаны демонстрируют более высокое разнообразие в составе и структуре сахара, чем у эукариот, и играют важную роль в процессах распознавания бактерий-хозяев и взаимодействия с окружающей средой. У патогенных бактерий гликопротеины были вовлечены в разные стадии инфекционного процесса, а модификации гликана могут мешать специфическим функциям гликопротеинов. Однако, несмотря на успехи, достигнутые в понимании состава гликана, структуры и путей биосинтеза, понимание роли гликопротеинов в патогенности или взаимодействии с окружающей средой остается очень ограниченным. Кроме того, у некоторых бактерий ферменты, необходимые для гликозилирования белка, совместно используются с другими полисахаридными биосинтетическими путями, такими как липополисахаридные и капсульные биосинтетические пути. Функциональная важность гликозилирования была выяснена у нескольких бактерий путем мутации специфических генов, которые, как считается, участвуют в процессе гликозилирования, и изучения его влияния на экспрессию целевого гликопротеина и модифицирующего гликана. Мезофильные аэромоны имеют одно- и О-гликозилированный полярный жгутик. Жгутиковые гликаны показывают разнообразие в углеводном составе и длине цепи между штаммами Aeromonas. Тем не менее, все штаммы, проанализированные на сегодняшний день, показывают производное псеудаминовой кислоты в качестве связующего сахара, который модифицирует остатки серина или треонина. Производное псеудаминовой кислоты требуется для сборки полярных жгутиков, и его потеря влияет на адгезию, образование биопленки и колонизацию. Протокол, подробно описанный в этой статье, описывает, как конструкция нулевых мутантов может быть использована для понимания участия генов или областей генома, содержащих предполагаемые гликозилтрансферазы, в биосинтезе жгутикового гликана. Это включает в себя потенциал для понимания функции вовлеченных гликозилтрансфераз и роли гликана. Это будет достигнуто путем сравнения гликан-дефицитного мутанта со штаммом дикого типа.
Introduction
Гликозилирование белка было описано как у грамположительных, так и у грамотрицательных бактерий и состоит из ковалентного прикрепления гликана к аминокислотной боковойцепи 1,2. У прокариот этот процесс обычно происходит через два основных ферментативных механизма: O- и N-гликозилирование 3. При О-гликозилировании гликан присоединяется к гидроксильной группе остатка серина (Ser) или треонина (Thr). При N-гликозилировании гликан присоединяется к боковой цепи амидного азота остатка аспарагина (Asn) в трипептидных последовательностях Asn-X-Ser/Thr, где X может быть любой аминокислотой, кроме пролина.
Гликаны могут принимать линейные или разветвленные структуры и состоят из моносахаридов или полисахаридов, ковалентно связанных гликозидными связями. У прокариот гликаны обычно демонстрируют разнообразие в составе и структуре сахара по сравнению с эукариотическими гликанами4. Кроме того, были описаны два различных пути бактериального гликозилирования, которые отличаются тем, как гликан собирается и переносится в акцепторный белок: последовательное и блоковое гликозилирование 5,6. Для последовательного гликозилирования сложный гликан накапливается непосредственно на белке путем последовательного добавления моносахаридов. При гликозилировании в блоке предварительно собранный гликан переносится в белок из липидно-связанного олигосахарида специализированной олигосахарилтрансферазой (OTase). Было показано, что оба пути участвуют в процессах N- и O-гликозилирования 7.
Гликозилирование белка играет роль в модуляции физико-химических и биологических свойств белков. Присутствие гликана может влиять на то, как белок взаимодействует со своим лигандом, что влияет на биологическую активность белка, но также может влиять на стабильность белка, растворимость, восприимчивость к протеолизу, иммуногенность и взаимодействия микроб-хозяин 8,9. Однако некоторые параметры гликозилирования, такие как количество гликанов, состав гликана, положение и механизм присоединения, также могут влиять на функцию и структуру белка.
Гликозилтрансферазы (ГТ) являются ключевыми ферментами в биосинтезе сложных гликанов и гликоконъюгатов. Эти ферменты катализируют образование гликозидной связи между фрагментом сахара из активированной донорской молекулы и специфическим акцептором субстрата. ГТ могут использовать как нуклеотиды, так и ненуклеотиды в качестве донорских молекул и нацеливаться на различные акцепторы субстрата, такие как белки, сахариды, нуклеиновые кислоты и липиды10. Поэтому понимание ГТ на молекулярном уровне важно для выявления их механизмов действия и специфичности, а также позволяет понять, как сахарный состав гликанов, которые модифицируют соответствующие молекулы, связаны с патогенностью. База данных активных ферментов углеводов (CAZy)11 классифицирует GT в соответствии с их гомологией последовательностей, что обеспечивает прогностический инструмент, поскольку в большинстве семейств GT структурная складка и механизмы действия инвариантны. Однако четыре причины затрудняют прогнозирование субстратной специфичности многих ГТ: 1) у прокариот не определен четкий мотив последовательности, определяющий специфичность субстрата12, 2) многие ГТ и ОТА показывают распущенность субстрата 13,14, 3) функциональные ГТ трудно получить при высоком выходе в рекомбинантной форме и 4) идентификация как донорских, так и акцепторных субстратов сложна. Несмотря на это, недавние исследования мутагенеза позволили получить значительные успехи в понимании каталитических механизмов и вычитании связывания ГТ.
У бактерий O-гликозилирование, по-видимому, более распространено, чем N-гликозилирование. Участки O-гликозилирования не показывают консенсусной последовательности, и многие из O-гликозилированных белков секретируются или белки клеточной поверхности, такие как жгутики, пили или аутотранспортеры1. Гликозилирование флагеллина показывает изменчивость в количестве акцепторных участков, составе гликана и структуре. Например, флагеллины Burkholderia spp имеют только один акцепторный участок, в то время как в Campylobacter jejuni жгутики имеют целых 19 акцепторных сайтов15,16. Кроме того, для некоторых бактерий гликан представляет собой один моносахарид, в то время как другие бактерии обладают гетерогенными гликанами, скомпрометированными различными моносахаридами с образованием олигосахаридов. Такая гетерогенность встречается даже среди штаммов одного вида. Хеликобактерные флагеллины модифицируются только псевдоминовой кислотой (PseAc)17, а флагеллины Campylobacter могут быть модифицированы PseAc, ацетамидиновой формой псеудаминовой кислоты (PseAm) или легионаминовой кислоты (LegAm), и гликанами, полученными из этих сахаров с ацетилом, N-ацетилглюкозамином или пропионными заменителями 18,19. В Aeromonas жгутики модифицируются гликанами, состав которых варьируется от одного производного кислоты PseAc до гетерополисахарида20, а присоединение гликанов к мономерам флагеллина всегда происходит через производное PseAc.
В целом, гликозилирование жгутиков имеет важное значение для сборки жгутиковой нити, подвижности, вирулентности и специфичности хозяина. Однако, в то время как флагеллины C. jejuni16, H. pylori17 и Aeromonas sp. 21 не может собираться в нить, если белковые мономеры не являются гликозилированными, Pseudomonas spp. и Burkholderia spp. 15 не требуют гликозилирования для сборки жгутиков. Кроме того, в некоторых штаммах C. jejuni изменения в сахарном составе жгутикового гликана влияют на взаимодействие бактерий с хозяином и могут играть роль в уклонении от определенных иммунных реакций16. Аутоагглютинация является еще одной фенотипической характеристикой, на которую влияют изменения в составе гликанов, связанных с жгутиками. Более низкая аутоагглютинация приводит к снижению способности образовывать микроколонии и биопленку22. У некоторых бактерий способность жгутиков вызывать провоспалительную реакцию была связана с жгутиковым гликозилированием. Таким образом, у P. aeruginosa гликозилированный жгутикеллин вызывает более высокую провоспалительную реакцию, чем у негликозилированный23.
Аэромоны являются грамотрицательными бактериями, повсеместно распространенными в окружающей среде, что позволяет им находиться на стыке всех компонентов One Health 24. Мезофильные аэромоны имеют один полярный жгутик, который конститутивно образуется. Более половины клинических изолятов также экспрессируют боковой флагеллин, индуцируемый в высоковязких средах или пластинах. Различные исследования связывают оба типа жгутиков с ранними стадиями бактериального патогенеза25. В то время как полярные жгутики, о которых сообщалось на сегодняшний день, являются O-гликозилированными при 5-8 Остатках Ser или Thr его центральных иммуногенных доменов, боковые жгутики не являются O-гликозилированными во всех штаммах. Хотя гликаны полярных жгутиков из разных штаммов демонстрируют разнообразие в своем углеводном составе и длине цепи20, было показано, что связывающий сахар является производным псеудаминовой кислоты.
Целью данной рукописи является описание способа получения нулевых мутантов в конкретных ГТ или хромосомных областях, содержащих ГТ, для анализа их участия в биосинтезе соответствующих полисахаридов и в бактериальной патогенности, а также роли самого гликана. В качестве примера мы идентифицируем и удаляем хромосомную область, содержащую GT Aeromonas , чтобы установить ее участие в гликозилировании полярного флагеллина и проанализировать роль гликана флагеллина. Показано, как удалить конкретный ГТ, чтобы установить его функцию в биосинтезе этого гликана и роль модифицированного гликана. Хотя используя Aeromonas в качестве примера, этот принцип может быть использован для идентификации и изучения островов гликозилирования жгутиков других грамотрицательных бактерий и анализа функции GT, участвующих в биосинтезе других гликанов, таких как липополисахарид O-антигена.
Protocol
Representative Results
Discussion
Критическим ранним этапом этого метода является идентификация областей, участвующих в гликозилировании жгутиков и предполагаемых ГТ, поскольку эти ферменты показывают высокую гомологию и участвуют во многих процессах. Биоинформационный анализ геномов Aeromonas в общедоступных баз?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Национальным исследовательским советом Канады, Национальным планом I+D (Ministerio de Economía y Competitividad, Испания) и Женералитатом Каталонии (Centre de Referència en Biotecnologia).
Materials
| ABI PRISM Big Dye Terminator v. 3.1 Cycle Sequencing Ready Reaction Kit | Applied Biosystems | 4337455 | Used for sequencing |
| AccuPrime Taq DNA Polymerase, high fidelity | Invitrogen | 12346-086 | Used for amplification of AB, CD and AD fragments |
| Agarose | Conda-Pronadise | 8008 | Used for DNA electrophoresis |
| Alkaline phosphatase, calf intestinal (CIAP) | Promega | M1821 | Used to remove phosphate at the 5’ end |
| Bacto agar | Becton Dickinson | 214010 | Use for motility analysis |
| BamHI | Promega | R6021 | Used for endonuclease restriction |
| BglII | Promega | R6081 | Used for endonuclease restriction |
| BioDoc-It Imagin System | UVP | Bio-imaging station used for DNA visualization | |
| Biotaq polymerase | Bioline | BIO-21040 | Used for colony screening |
| Cesium chloride | Applichem | A1126,0100 | Used for flagella purification |
| Chloramphenicol | Applichem | A1806,0025 | Used for triparental mating |
| Cytiva illustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit | Cytivia | 28-9034-71 | Used for purification of PCR amplicons and DNA fragments. |
| EDTA | Applichem | 131026.1211 | Used for DNA electrophoresis |
| Electroporation cuvettes 2 mm gap | VWR | 732-1133 | Used for transformation |
| Ethidium bromide | Applichem | A1152,0025 | Use for DNA visualization |
| HyperLadder 1 Kb marker | Bioline | BIO-33053 | DNA marker |
| Invitrogen Easy-DNA gDNA Purification Kit | Invitrogen | 10750204 | Used for bacterial chromosomal DNA purification |
| Luria-Bertani (LB) Miller agar | Condalab | 996 | Used for Escherichia coli culture |
| Luria-Bertani (LB) Miller broth | Condalab | 1551 | Used for Escherichia coli culture |
| Nanodrop ND-1000 | NanoDrop Techonologies Inc | Spectrophotometer used for DNA quantification | |
| Rifampicin | Applichem | A2220,0005 | Used for triparental mating |
| SOC Medium | Invitrogen | 15544034 | Used for electroporation recovery |
| Spectinomycin | Applichem | A3834,0005 | Used for triparental mating |
| SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman | 331362 | Used for flagella purification |
| T4 DNA ligase | Invitrogen | 15224017 | Used for ligation reaction |
| Trypticasein soy agar | Condalab | 1068 | Used for Aeromonas grown |
| Trypticasein soy broth | Condalab | 1224 | Used for Aeromonas grown |
| Tryptone | Condalab | 1612 | Use for motility analysis |
| Tris | Applichem | A2264,0500 | Used for DNA electrophoresis and flagella purification |
| Triton X-100 | Applichem | A4975,0100 | Used for bacterial lysis |
| Ultra Clear tubes (14 mm x 89 mm) | Beckman | 344059 | Used for flagella purification |
| Veriti 96 well Thermal Cycler | Applied Biosystems | Used for PCR reactions | |
| Zyppy Plasmid Miniprep II Kit | Zymmo research | D4020 | Used for isolation of plasmid DNA |
Riferimenti
- Schäffer, C., Messner, P. Emerging facets of prokaryotic glycosylation. FEMS Microbiology Review. 41 (1), 49-91 (2017).
- De Maayer, P., Cowan, D. A. Flashy flagella: flagellin modification is relatively common and highly versatile among the Enterobacteriaceae. BMC Genomics. 17, 377 (2016).
- Nothaft, H., Szymanski, C. M. Protein glycosylation in bacteria: sweeter than ever. Nature Review Microbiology. 8 (11), 765-778 (2010).
- Benz, I., Schmidt, M. A. Never say never again: protein glycosylation in pathogenic bacteria. Molecular Microbiology. 45 (2), 267-276 (2002).
- Guerry, P., Szymanski, C. M. Campylobacter sugars sticking out. Trends in Microbiology. 16 (9), 428-435 (2008).
- Hug, I., Feldman, M. F. Analogies and homologies in lipopolysaccharide and glycoprotein biosynthesis in bacteria. Glycobiology. 21 (2), 138-151 (2011).
- Iwashkiw, J. A., Vozza, N. F., Kinsella, R. L., Feldman, M. F. Pour some sugar on it: the expanding world of bacterial protein O-linked glycosylation. Molecular Microbiology. 89 (1), 14-28 (2013).
- Szymanski, C. M., Wren, B. W. Protein glycosylation in bacterial mucosal pathogens. Nature Review Microbiology. 3, 225-237 (2005).
- Tan, F. Y. Y., Tang, C. M., Exley, R. M. Sugar coating: bacterial protein glycosylation and host-microbe interactions. Trends Biochemistry Sciences. 40 (7), 342-350 (2015).
- Lairson, L. L., Henrissat, B., Davies, G. J., Withers, S. G. Glycosyltransferases: structures, functions, and mechanisms. Annual Review Biochemistry. 77, 521-555 (2008).
- Lombard, V., Golaconda Ramulu, H., Drula, E., Coutinho, P. M., Henrissat, B. The carbohydrate-active enzymes database (CAZy) in 2013. Nucleic Acids Research. 42, 490-495 (2014).
- Weerapana, E., Imperiali, B. Asparagine-linked protein glycosylation: from eukaryotic to prokaryotic systems. Glycobiology. 16 (6), 91 (2006).
- Faridmoayer, A., et al. Extreme substrate promiscuity of the Neisseria oligosaccharyl transferase involved in protein O-glycosylation. Journal of Biological Chemistry. 283 (50), 34596-34604 (2008).
- Wacker, M., et al. Substrate specificity of bacterial oligosaccharyltransferase suggests a common transfer mechanism for the bacterial and eukaryotic systems. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (18), 7088-7093 (2006).
- Scott, A. E., et al. Flagellar glycosylation in Burkholderia pseudomallei and Burkholderia thailandensis. Journal of Bacteriology. 193 (14), 3577-3587 (2011).
- Thibault, P., et al. Identification of the carbohydrate moieties and glycosylation motifs in Campylobacter jejuni flagellin. Journal of Biological Chemistry. 276 (37), 34862-34870 (2001).
- Schirm, M., et al. Structural, genetic and functional characterization of the flagellin glycosylation process in Helicobacter pylori. Molecular Microbiology. 48 (6), 1579-1592 (2003).
- McNally, D. J., et al. Targeted metabolomics analysis of Campylobacter coli VC167 reveals legionaminic acid derivatives as novel flagellar glycans. Journal of Biological Chemistry. 282 (19), 14463-14475 (2007).
- Logan, S. M., et al. Identification of novel carbohydrate modifications on Campylobacter jejuni 11168 flagellin using metabolomics-based approaches. FEBS Journal. 276 (4), 1014-1023 (2009).
- Wilhelms, M., Fulton, K. M., Twine, S. M., Tomás, J. M., Merino, S. Differential glycosylation of polar and lateral flagellins in Aeromonas hydrophila AH-3. Journal of Biological Chemistry. 287 (33), 27851-27862 (2012).
- Canals, R., et al. Non-structural flagella genes affecting both polar and lateral flagella-mediated motility in Aeromonas hydrophila. Microbiology. 153, 1165-1175 (2007).
- Howard, S. L., et al. Campylobacter jejuni glycosylation island important in cell charge, legionaminic acid biosynthesis, and colonization of chickens. Infection and Immunity. 77 (6), 2544-2556 (2009).
- Verma, A., Arora, S. K., Kuravi, S. K., Ramphal, R. Roles of specific amino acids in the N-terminus of Pseudomonas aeruginosa flagellin and of flagellin glycosylation in the innate immune response. Infection and Immunity. 73 (12), 8237-8246 (2005).
- Lamy, B., Baron, S., Barraud, O. Aeromonas: the multifaceted middleman in the One Health world. Current Opinion in Microbiology. 65, 24-32 (2022).
- Gavín, R., et al. Lateral flagella of Aeromonas species are essential for epithelial cell adherence and biofilm formation. Molecular Microbiology. 43 (2), 383-397 (2002).
- Altschul, F. S., et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Research. 25 (17), 3389-3402 (1997).
- Forn-Cuní, G., et al. Polar flagella glycosylation in Aeromonas: Genomic characterization and Involvement of a specific glycosyltransferase (Fgi-1) in heterogeneous flagella glycosylation. Frontiers in Microbiology. 11, 595697 (2021).
- Milton, D. L., O’Toole, R., Horstedt, P., Wolf-Watz, H. Flagellin A is essential for the virulence of Vibrio anguillarum. Journal of Bacteriol.ogy. 178 (5), 1310-1319 (1996).
- Kovács, N. Identification of Pseudomonas pyocyanea by the oxidase reaction. Nature. 178 (4535), 703 (1956).
- Fulton, K. M., Mendoza-Barberá, E., Twine, S. M., Tomás, J. M., Merino, S. Polar glycosylated and lateral non-glycosylated flagella from Aeromonas hydrophila strain AH-1 (Serotype O11). International Journal of Molecular Sciences. 16 (12), 28255-28269 (2015).
- Khider, M., Willassen, N. P., Hansen, H. The alternative sigma factor RpoQ regulates colony morphology, biofilm formation and motility in the fish pathogen Aliivibrio salmonicida. BMC Microbiology. 18 (1), 116 (2018).
- Pawar, S. V., et al. Novel genetic tools to tackle c-di-GMP-dependent signalling in Pseudomonas aeruginosa. Journal of Applied Microbiology. 120 (1), 205-217 (2016).
- Vander Broek, W., Chalmers, K. J., Stevens, M. P., Stevens, J. M. Quantitative proteomic analysis of Burkholderia pseuomallei Bsa Type III secretion system effectors using hypersecreting mutants. The American Society for Biochemistry and Molecular Biology. 14 (4), 905-916 (2015).
