Generering av nollmutanter för att belysa rollen som bakteriella glykosyltransferaser i bakteriell motilitet

Summary

Här beskriver vi konstruktionen av nollmutanter av Aeromonas i specifika glykosyltransferaser eller regioner innehållande glykosyltransferaser, motilitetsanalyserna och flagellarening som utförs för att fastställa involveringen och funktionen hos deras kodade enzymer i biosyntesen av en glykan, liksom rollen för denna glykan i bakteriell patogenes.

Abstract

Studien av glykosylering i prokaryoter är ett snabbt växande område. Bakterier har olika glykosylerade strukturer på ytan vars glykaner utgör en stamspecifik streckkod. De associerade glykanerna visar högre mångfald i sockerkomposition och struktur än hos eukaryoter och är viktiga i bakteriell-värdigenkänningsprocesser och interaktion med miljön. I patogena bakterier har glykoproteiner varit involverade i olika stadier av den infektiösa processen, och glykanmodifieringar kan störa specifika funktioner hos glykoproteiner. Trots de framsteg som gjorts i förståelsen av glykankomposition, struktur och biosyntesvägar är förståelsen för glykoproteinernas roll i patogenicitet eller interaktion med miljön fortfarande mycket begränsad. Vidare delas i vissa bakterier de enzymer som krävs för proteinglykosylering med andra polysackaridbiosyntetiska vägar, såsom lipopolysackarid och kapselbiosyntetiska vägar. Den funktionella betydelsen av glykosylering har belysts i flera bakterier genom mutation av specifika gener som tros vara involverade i glykosyleringsprocessen och studien av dess inverkan på uttrycket av målglykoproteinet och den modifierande glykanen. Mesofila Aeromonas har en enda och O-glykosylerad polär flagellum. Flagellärglykaner visar mångfald i kolhydratsammansättning och kedjelängd mellan Aeromonas-stammar . Alla stammar som hittills analyserats visar emellertid ett pseudaminsyraderivat som det länkande sockret som modifierar serin- eller treoninrester. Pseudaminsyraderivatet krävs för polär flagellamontering, och dess förlust har en inverkan på vidhäftning, biofilmbildning och kolonisering. Protokollet som beskrivs i denna artikel beskriver hur konstruktionen av nollmutanter kan användas för att förstå involveringen av gener eller genomregioner som innehåller förmodade glykosyltransferaser i biosyntesen av en flagellär glykan. Detta inkluderar potentialen att förstå funktionen hos de involverade glykosyltransferaserna och glykanens roll. Detta kommer att uppnås genom att jämföra glykanbristmutanten med vildtypsstammen.

Introduction

Proteinglykosylering har beskrivits i både grampositiva och gramnegativa bakterier och består av den kovalenta bindningen av en glykan till en aminosyra sidokedja ^1,2. I prokaryoter sker denna process vanligtvis via två stora enzymatiska mekanismer: O- och N-glykosylering ³. Vid O-glykosylering är glykanen bunden till hydroxylgruppen av en serin (Ser) eller treonin (Thr) rest. Vid N-glykosylering är glykanen bunden till sidokedjeamidkväve av en asparagin (Asn) rest inom tripeptidsekvenserna Asn-X-Ser / Thr, där X kan vara vilken aminosyra som helst utom prolin.

Glykaner kan anta linjära eller grenade strukturer och består av monosackarider eller polysackarider kovalent kopplade av glykosidbindningar. I prokaryoter visar glykaner vanligtvis mångfald i sockerkomposition och struktur i jämförelse med eukaryota glykaner⁴. Vidare har två olika bakteriella glykosyleringsvägar som skiljer sig åt i hur glykanen sätts ihop och överförs till acceptorproteinet beskrivits: sekventiell och en bloc glykosylering ^5,6. För sekventiell glykosylering byggs den komplexa glykanen upp direkt på proteinet genom successiv tillsats av monosackarider. Vid en bloc glykosylering överförs en förmonterad glykan till proteinet från en lipidbunden oligosackarid genom ett specialiserat oligosackaryltransferas (OTase). Båda vägarna har visat sig vara involverade i N- och O-glykosyleringsprocesser ⁷.

Proteinglykosylering har en roll i modulering av de fysikalisk-kemiska och biologiska egenskaperna hos proteiner. Närvaron av en glykan kan påverka hur proteinet interagerar med sin ligand, vilket påverkar proteinets biologiska aktivitet, men kan också påverka proteinstabilitet, löslighet, mottaglighet för proteolys, immunogenicitet och mikrob-värdinteraktioner ^8,9. Emellertid kan flera glykosyleringsparametrar, såsom antalet glykaner, glykansammansättning, position och bindningsmekanism, också påverka proteinfunktionen och strukturen.

Glykosyltransferaser (GT) är de viktigaste enzymerna i biosyntesen av komplexa glykaner och glykokonjugat. Dessa enzymer katalyserar den glykosidiska bindningsbildningen mellan en sockerdel från en aktiverad donatormolekyl och en specifik substratacceptor. GT kan använda både nukleotider och icke-nukleotider som donatormolekyler och rikta in sig på olika substratacceptorer, såsom proteiner, sackarider, nukleinsyror och lipider¹⁰. Därför är det viktigt att förstå GT på molekylär nivå för att identifiera deras verkningsmekanismer och specificitet, och gör det också möjligt att förstå hur sockerkompositionen hos glykaner som modifierar relevanta molekyler är relaterade till patogenicitet. Kolhydrataktiv enzymdatabas (CAZy)¹¹ klassificerar GT enligt deras sekvenshomologi, vilket ger ett prediktivt verktyg eftersom i de flesta GT-familjerna är den strukturella vikningen och verkningsmekanismerna invarianta. Fyra skäl gör det dock svårt att förutsäga substratspecificitet hos många GT: 1) inget tydligt sekvensmotiv som bestämmer substratspecificitet har bestämts i prokaryoter¹², 2) många GT och OTases visar substratpromiskuitet ^13,14, 3) funktionella GT är svåra att producera i högt utbyte i rekombinant form och 4) identifieringen av både donator- och acceptorsubstrat är komplex. Trots detta har de senaste mutagenesstudierna gjort det möjligt att erhålla betydande framsteg i förståelsen av katalytiska mekanismer och subtrahera bindning av GT.

I bakterier verkar O-glykosylering vara vanligare än N-glykosylering. O-glykosyleringsställena visar ingen konsensussekvens, och många av de O-glykosylerade proteinerna utsöndras eller cellyteproteiner, såsom flagelliner, pili eller autotransporter¹. Flagellin glykosylering visar variation i antalet acceptorställen, glykankomposition och struktur. Till exempel har Burkholderia spp flagellins bara en acceptorplats, medan i Campylobacter jejuni har flagelliner så många som 19 acceptorplatser^15,16. Vidare är glykanen för vissa bakterier en enda monosackarid, medan andra bakterier har heterogena glykaner som komprometteras av olika monosackarider för att bilda oligosackarider. Denna heterogenitet förekommer även bland stammar av samma art. Helicobacter flagelliner modifieras endast av pseudaminsyra (PseAc)¹⁷, och Campylobacter flagelliner kan modifieras av PseAc, acetamidinoformen av pseudaminsyra (PseAm) eller legionaminsyra (LegAm) och glykaner härledda från dessa sockerarter med acetyl, N-acetylglukosamin eller propioniska substitutioner^18,19. I Aeromonas modifieras flagelliner av glykaner vars sammansättning sträcker sig från ett enda PseAc-syraderivat till en heteropolysackarid²⁰, och bindningen av glykaner till flagellinmonomererna sker alltid via ett PseAc-derivat.

I allmänhet är glykosylering av flagelliner avgörande för flagellär filamentmontering, rörlighet, virulens och värdspecificitet. Men medan flagelliner av C. jejuni¹⁶, H. pylori^{17 och} Aeromonas sp. ²¹ kan inte sättas ihop till filament om inte proteinmonomererna är glykosylerade, Pseudomonas spp. ¹⁵ kräver inte glykosylering för flagellamontering. Dessutom, i vissa C. jejuni-stammar, påverkar förändringar i sockersammansättningen av flagellaglykan bakteriell-värdinteraktion och kan spela en roll för att undvika vissa immunsvar¹⁶. Autoagglutination är en annan fenotypisk egenskap som påverkas av modifieringar i sammansättningen av glykaner associerade med flagelliner. En lägre autoagglutination leder till en minskning av förmågan att bilda mikrokolonier och biofilm²². I vissa bakterier var flagellens förmåga att utlösa ett proinflammatoriskt svar kopplat till flagellinglykosylering. Således inducerar glykosylerat flagellin i P. aeruginosa ett högre proinflammatoriskt svar än otykosylerat²³.

Aeromonas är gramnegativa bakterier som finns överallt i miljön, vilket gör att de kan vara i gränssnittet för alla One Health-komponenter ²⁴. Mesofila Aeromonas har ett enda polärt flagellum, som är konstitutivt producerat. Mer än hälften av kliniska isolat uttrycker också lateral flagellin, inducerbar i medier eller plattor med hög viskositet. Olika studier har relaterat båda flagelltyperna med de tidiga stadierna av bakteriell patogenes²⁵. Medan polära flagelliner som hittills rapporterats är O-glykosylerade vid 5-8 Ser- eller Thr-rester av dess centrala immunogena domäner, är laterala flagelliner inte O-glykosylerade i alla stammar. Även om polära flagellaglykaner från olika stammar visar mångfald i sin kolhydratsammansättning och kedjelängd²⁰, har det länkande sockret visat sig vara ett pseudaminsyraderivat.

Målet med detta manuskript är att beskriva en metod för att erhålla nollmutanter i specifika GT eller kromosomala regioner innehållande GT för att analysera deras engagemang i biosyntesen av relevanta polysackarider och i bakteriell patogenicitet, liksom glykanens roll. Som ett exempel identifierar och tar vi bort en kromosomal region som innehåller GT av Aeromonas för att fastställa dess engagemang i polär flagellinglykosylering och analysera flagellinglykanens roll. Vi visar hur man tar bort en specifik GT för att fastställa dess funktion i biosyntesen av denna glykan och rollen som modifierad glykan. Även om aeromonas används som exempel kan principen användas för att identifiera och studera flagellaglykosyleringsöar av andra gramnegativa bakterier och analysera funktionen hos GT som är involverade i biosyntesen av andra glykaner, såsom O-antigen lipopolysackarid.

Protocol

Den schematiska representationen av proceduren visas i figur 1. 1. Bioinformatisk identifiering av flagellaglykosyleringsö (GCI) i Aeromonas För att identifiera PseAc biosyntetiska kluster i Aeromonas genom, använd tblastn-verktyget från NCBI-databasen26. Hämta först ortologa proteiner till PseC och PseI av A. piscicola AH-3 (identifieringskoderna är OCA61126.1 och OCA611…

Representative Results

Denna metod ger ett effektivt system för att generera nollmutanter i gener eller kromosomala regioner i Aeromonas som kan påverka flagellaglykosylering och flagellafilamentets roll (Figur 1). Protokollet börjar med den bioinformatiska identifieringen av förmodade FGIs och generna som kodar för GT presenteras i denna region. I Aeromonas är den kromosomala placeringen av FGIs baserad på detektion av tre typer av gener: gener som är involver…

Discussion

Det kritiska tidiga steget i denna metod är identifieringen av regioner som är involverade i glykosylering av flageller och förmodade GT eftersom dessa enzymer visar hög homologi och är involverade i många processer. Bioinformatisk analys av Aeromonas genom i offentliga databaser visar att denna region ligger intill den polära flagellregionen 2, som innehåller flagellingenerna i många stammar och innehåller gener som är involverade i biosyntesen av pseudaminsyra²⁷. Detta har gj…

Materials

ABI PRISM Big Dye Terminator v. 3.1 Cycle Sequencing Ready Reaction Kit	Applied Biosystems	4337455	Used for sequencing
AccuPrime Taq DNA Polymerase, high fidelity	Invitrogen	12346-086	Used for amplification of AB, CD and AD fragments
Agarose	Conda-Pronadise	8008	Used for DNA electrophoresis
Alkaline phosphatase, calf intestinal (CIAP)	Promega	M1821	Used to remove phosphate at the 5’ end
Bacto agar	Becton Dickinson	214010	Use for motility analysis
BamHI	Promega	R6021	Used for endonuclease restriction
BglII	Promega	R6081	Used for endonuclease restriction
BioDoc-It Imagin System	UVP		Bio-imaging station used for DNA visualization
Biotaq polymerase	Bioline	BIO-21040	Used for colony screening
Cesium chloride	Applichem	A1126,0100	Used for flagella purification
Chloramphenicol	Applichem	A1806,0025	Used for triparental mating
Cytiva illustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit	Cytivia	28-9034-71	Used for purification of PCR amplicons and DNA fragments.
EDTA	Applichem	131026.1211	Used for DNA electrophoresis
Electroporation cuvettes 2 mm gap	VWR	732-1133	Used for transformation
Ethidium bromide	Applichem	A1152,0025	Use for DNA visualization
HyperLadder 1 Kb marker	Bioline	BIO-33053	DNA marker
Invitrogen Easy-DNA gDNA Purification Kit	Invitrogen	10750204	Used for bacterial chromosomal DNA purification
Luria-Bertani (LB) Miller agar	Condalab	996	Used for Escherichia coli culture
Luria-Bertani (LB) Miller broth	Condalab	1551	Used for Escherichia coli culture
Nanodrop ND-1000	NanoDrop Techonologies Inc		Spectrophotometer used for DNA quantification
Rifampicin	Applichem	A2220,0005	Used for triparental mating
SOC Medium	Invitrogen	15544034	Used for electroporation recovery
Spectinomycin	Applichem	A3834,0005	Used for triparental mating
SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor	Beckman	331362	Used for flagella purification
T4 DNA ligase	Invitrogen	15224017	Used for ligation reaction
Trypticasein soy agar	Condalab	1068	Used for Aeromonas grown
Trypticasein soy broth	Condalab	1224	Used for Aeromonas grown
Tryptone	Condalab	1612	Use for motility analysis
Tris	Applichem	A2264,0500	Used for DNA electrophoresis and flagella purification
Triton X-100	Applichem	A4975,0100	Used for bacterial lysis
Ultra Clear tubes (14 mm x 89 mm)	Beckman	344059	Used for flagella purification
Veriti 96 well Thermal Cycler	Applied Biosystems		Used for PCR reactions
Zyppy Plasmid Miniprep II Kit	Zymmo research	D4020	Used for isolation of plasmid DNA