الإنتاج الضخم للفطريات المسببة للأمراض الحشرية ، Metarhizium robertsii و Metarhizium pinghaense ، للتطبيق التجاري ضد الآفات الحشرية
Summary
اكتسبت الفطريات المسببة للأمراض الحشرية أهمية باعتبارها عوامل المكافحة البيولوجية للآفات الحشرية الزراعية. في هذه الدراسة ، تم بنجاح الإنتاج الضخم لعدد كاف من البروباغولات المعدية المرنة لعزلات جنوب أفريقيا لكل من Metarhizium robertsii و M. pinghaense للتطبيق التجاري ضد الآفات الحشرية باستخدام منتجات الحبوب الزراعية.
Abstract
اكتسبت الفطريات المسببة للأمراض الحشرية في مجمع أنواع Metarhizium anisopliae أهمية باعتبارها عوامل المكافحة البيولوجية للآفات الحشرية الزراعية. وقد أدت الزيادة في مقاومة الآفات للمبيدات الحشرية الكيميائية، والمخاوف المتزايدة بشأن الآثار السلبية للمبيدات الحشرية على صحة الإنسان، والتلوث البيئي الناجم عن مبيدات الآفات إلى حملة عالمية لإيجاد استراتيجيات مستدامة جديدة لحماية المحاصيل ومكافحة الآفات. في السابق ، أجريت محاولات لزراعة أنواع الفطريات المسببة للأمراض الحشرية (EPF) مثل Beauveria bassiana. ومع ذلك ، لم تجر سوى محاولات محدودة للاستزراع الجماعي Metarhizium robertsii و M. pinghaense لاستخدامها ضد الآفات الحشرية. هدفت هذه الدراسة إلى إنتاج عدد كاف من البروباغولات المعدية المرنة لعزلات جنوب أفريقيا من M. robertsii و M. pinghaense للتطبيق التجاري. تم استخدام ثلاثة منتجات من الحبوب الزراعية ، الشوفان المقشر ، والشعير المقشر ، والأرز ، كركائز تخمير صلبة EPF. تم استخدام طريقتين للتلقيح ، المعلقات المخروطية وثقافة الفطريات السائلة للأبواسير الأريمية لتلقيح الركائز الصلبة. ولوحظ أن التلقيح باستخدام المعلقات المخروطية أقل فعالية نسبيا، حيث لوحظت مستويات متزايدة من التلوث على الركائز الصلبة مقارنة باستخدامها عند استخدام طريقة تلقيح الأروميات. تم العثور على الشوفان المقشر ليس ركيزة نمو مناسبة لكل من M. robertsii و M. pinghaense ، حيث لم يتم حصاد أي كونيديا جافة من الركيزة. وجد أن الشعير المقشر يفضل إنتاج M. robertsii conidia على إنتاج M. pinghaense ، وتم حصاد ما معدله 1.83 جم ± 1.47 جم من M. robertsii conidia الجاف وصفر جرام من M. pinghaense conidia من الركيزة. وجد أن حبوب الأرز تفضل الإنتاج الضخم المخروطي لكل من عزلات M. pinghaense و M. robertsii ، بمتوسط 8.2 جم ± 4.38 جم و 6 جم ± 2 جم يتم حصادها من الركيزة ، على التوالي.
Introduction
اكتسبت الفطريات المسببة للأمراض الحشرية (EPF) أهمية كعوامل لحماية المحاصيل في المكافحة البيولوجية للآفات الحشرية الزراعية الهامة 1,2. مسببات الأمراض الحشرية ، التي تحدث بشكل طبيعي في التربة ، تسبب الأوبئة الحيوانية في مجموعات أنواع الآفات المختلفة3. أنواع EPF خاصة بالمضيف وتشكل مخاطر قليلة نسبيا من حيث مهاجمة الأنواع غير المستهدفة ، وهي غير سامة للبيئة4. لدى EPF آلية فريدة لغزو مضيفها ، وكذلك للانتشار والاستمرار في بيئتها المباشرة1. يهاجمون المضيف بشكل رئيسي من خلال الجراثيم اللاجنسية التي تلتصق ببشرة المضيف وتخترقها لغزو وتكاثر في الهيموكول المضيف. يموت المضيف في النهاية بسبب استنفاد العناصر الغذائية الليمفاوية أو نتيجة لتوكسيوم الدم الناجم عن المستقلبات السامة التي تطلقها الفطريات. بعد الموت ، في ظل ظروف بيئية مثالية ، تظهر الفطريات على السطح الخارجي (الفطار العلني) للجثة المضيفة 5,6.
أدت المخاوف المتزايدة بشأن الآثار السلبية للمخلفات الكيميائية على صحة الإنسان والتلوث البيئي وتطوير مقاومة الآفات إلى الحملة العالمية للحد من مدخلات المبيدات الحشرية القائمة على المواد الكيميائية وإيجاد استراتيجيات بديلة وجديدة ومستدامة لحماية المحاصيل ومكافحة الآفات 6,7,8 . وقد وفر ذلك فرصا لتطوير مبيدات حشرية قائمة على الميكروبات لاستخدامها في برامج الإدارة المتكاملة للآفات (IPM) ، والتي تعد استراتيجيات أكثر ملاءمة من الناحية البيئية من المكافحة الكيميائية التقليدية 3,8.
لتطوير عامل مكافحة ميكروبي ناجح لآفة زراعية ، يجب أولا عزل كائن حي مناسب وتوصيفه وتحديده وتأكيد إمراضه للآفة المستهدفة. ومع ذلك، يلزم وجود طريقة سهلة وفعالة من حيث التكلفة لإنتاج العامل الميكروبي على نطاق واسع لإنتاج منتج قابل للتطبيق للاستخدام في برامج المكافحة البيولوجية9،10،11،12،13. يعتمد الإنتاج الضخم لكميات كبيرة من مسببات الأمراض الحشرية ذات النوعية الجيدة على السلالة الميكروبية والبيئة والآفة المستهدفة والتركيبة والسوق واستراتيجية التطبيق والمنتج النهائي المطلوب 14،15،16. يمكن إنتاج EPF بكميات كبيرة باستخدام تخمير الركيزة السائلة لإنتاج الأروميات أو عملية تخمير الركيزة الصلبة لإنتاج كونيديا هوائية6،17،18. ومع ذلك ، فإن عملية الإنتاج الضخم وصياغة مسببات الأمراض الحشرية تؤثر بشكل مباشر على الضراوة والتكلفة والعمر الافتراضي والفعالية الميدانية للمنتج النهائي. من أجل الاستخدام الناجح في الإدارة المتكاملة للآفات ، يجب أن تكون عملية إنتاج مسببات الأمراض الحشرية سهلة التشغيل ، وتتطلب الحد الأدنى من العمالة ، وتنتج تركيزا عالي الغلة من البروباغولات الخبيثة والقابلة للحياة والمستمرة ، وأن تكون منخفضة التكلفة4،13،14،16.
فهم المتطلبات الغذائية لمسببات الأمراض الحشرية مهم للزراعة الجماعية مع جميع طرق الزراعة 4,12. المكونات الغذائية لوسط الإنتاج لها تأثير كبير على سمات البروباغولات الناتجة ، بما في ذلك فعالية المكافحة الحيوية ، والعائد ، وتحمل الجفاف ، والثبات8،19،20،21. تم تصميم تحسين إجراءات الإنتاج لمعالجة هذه العوامل22. بالنسبة ل EPF ، فإن المتطلبات الرئيسية للنمو الجيد ، والجراثيم ، والإنتاج الضخم للكونيديا الفطرية هي الرطوبة الكافية ، ودرجة حرارة النمو المثلى ، ودرجة الحموضة ، وتبادل الغازات من CO 2 و O2 ، والتغذية، بما في ذلك مصادر الفوسفور والكربوهيدرات والكربون والنيتروجين الجيدة18.
يصف جارونسكي وجاكسون18 طريقة تخمير الركيزة الصلبة بأنها الطريقة الأكثر كفاءة والأقرب للتقريب إلى العملية الطبيعية لإنتاج EPF بالنسبة لطريقة تخمير الركيزة السائلة لأنه ، في ظل الظروف الطبيعية ، يتم حمل الكونيديوم الفطري على هياكل منتصبة صلبة ، مثل سطح جثث الحشرات. تستخدم المنتجات الزراعية والمنتجات الثانوية التي تحتوي على النشا في الغالب للإنتاج الضخم للفطريات hypocrealean ، حيث أن الفطريات تتحلل بسهولة النشا من خلال إفراز إنزيمات هيدروليتية عالية التركيز من أطرافها الواصلة ، لاختراق المادة الصلبة ، والوصول إلى العناصر الغذائية الموجودة في المادة 11،17،18،23 . توفر منتجات الحبوب أيضا متطلبات إنتاج الكتلة الحيوية الصحية لأنه عندما يتم ترطيبها وتعقيمها ، يمكن للركائز امتصاص المزيد من العناصر الغذائية من أي وسط سائل16،18،24.
في السابق ، حاولت العديد من الدراسات زراعة أنواع EPF مثل Beauveria bassiana (Bals). Vuil., Cordyceps fumosorosea (Wize) Kelper B. Shrestha & Spatafora, Verticillium lecanii (Zimm.) Viegas وبعض من Metarhizium anisopliae (Metschn.) أنواع السوروكين المعقدة تعزل على ركائز مختلفة16،23،24. وتشمل هذه العزلات المنتجة بكميات كبيرة والمطورة تجاريا العضلات® الخضراء (سلالة IMI 330189) ، التي تم تطويرها من M. anisopliae var Metarhizium acridum (Driver & Milner) J.F. Bisch و Rehner & Humber و Metarhizium 69 (سلالة Meta 69 ICIPE69) ، و Real Metarhizium 69 (L9281) ، التي تم تطويرها من M. anisopliae ، و Broadband® (سلالة PPRI 5339) و Eco-Bb® ، التي تم تطويرها من B. bassiana25,26 . ومع ذلك ، فقد بذلت محاولات محدودة للثقافة الجماعية Metarhizium robertsii J.F. Bisch. و S.A. Rehner & Humber و Metarhizium pinghaense Chen & Guo. تم اختيار هذين العزلين في دراسة سابقة كالأكثر فعالية للسيطرة على البق الدقيقي ، Pseudococcus viburni Signoret (Hemiptera: Pseudococcidae)27. ولذلك، تهدف الدراسة الحالية إلى صياغة وإنتاج عدد كاف من البروباغولات المعدية المرنة للعزلات المحلية ل M. robertsii و M. pinghaense للتطبيق التجاري ضد الآفات الحشرية. تم استخدام طريقة تخمير الركيزة الصلبة لإنتاج الكونيديا الفطرية بكميات كبيرة لكل من عزلات EPF. تم استخدام طريقتين لتلقيح EPF ، باستخدام المعلقات المخروطية والثقافة الفطرية السائلة للأبواسير الأريمية ، لتلقيح الركائز الصلبة.
Protocol
Representative Results
Discussion
يعتمد الدمج الناجح للعوامل الميكروبية للمكافحة البيولوجية للآفات الحشرية الزراعية الهامة في النظام الإيكولوجي الزراعي على نجاح وسهولة الإنتاج الضخم لمسببات الأمراض الحشرية كخطوة أولى في ظل الظروف المختبرية. الإنتاج الضخم ل EPF مهم للتطبيق على نطاق واسع وتوافر منتجات EPF لبرامج الإدارة ال…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يود المؤلفون أن يشكروا هورت بوم وهورت ستون وبرنامج التكنولوجيا والموارد البشرية للصناعة (THRIP: TP14062571871) على تمويل المشروع.
أوركيد:
http://orcid.org/0000-0002-5118-3578 ليتودي ل. ماثولوي
أنطوانيت ب. مالان http://orcid.org/0000-0002-9257-0312
نوماخولوا ف. ستوكوي http://orcid.org/0000-0003-2869-5652
Materials
| 0.05% Tween 20 | Lasec | Added to conidial suspensions to allow fungal spores to mix with water | |
| 20 mL McCartney bottles | Lasec | Used to make conidial suspensions | |
| Aluminium foil | Used as a cover of the cotton wool plugs on 250-mL flask | ||
| Autoclave | Used to sterilize materials and ingredients used for the conidia production process | ||
| Autoclave bags | Lasec | Fermentation bags or solid substrate containers | |
| Autoclave tape | Lasec | To secure PVC pipes on the fermentation bags | |
| Brown Kraft paper bags | Used to dry conidia cultures on agricultural grains | ||
| Bunsen burnner | Labnet (Labnet International, Inc.) | Used to flame equipment (surgical blades,inoculating loops and rims of flasks) | |
| Clear edge test sieve | Used to separate fungal conidia from agricultural grain substrates | ||
| Corn steep liquor | SIGMA | 66071-94-1 | Ingredient of the blastospore liquid medium |
| Cotton Wool | Lasec | Used as plug of the neck for fermentation bags | |
| Duran laboratory bottles | Neolab | Used to autoclave SDA medium and distilled water | |
| Electrical tape | Used to tape and seal the sieve joints to prevent the escape of conidial dust | ||
| ENDECOTTS test sieve | Used to separate fungal conidia from agricultural grain substrates | ||
| Erlenmeyer Flasks, Narrow neck,250-mL flask | Lasec | Carrier of the blastospore liquid medium | |
| Ethanol (99%) | Lasec | Used to sterilize surgical blades and inoculating loops | |
| Flaked barley | Health Connection Wholefoods | Agricultural grain used as a solid substrate growth medium for conidia of both M. pinghaense and M. robertsii | |
| Flaked oats | Tiger brands | Agricultural grain used as a solid substrate growth medium for conidia of both M. pinghaense and M. robertsii | |
| Glucose | Merck | Ingredient of the blastospore liquid medium | |
| Growth Chamber/ incubators | For growing fungal conidia culture | ||
| Haemocytometer | Used to determine conidial concentrations | ||
| Inoculating loops | Lasec | For harvesting spores to innoculate liquid medium for blastospores growth | |
| Kitchen rolling pin | Used to manipulate the solid grain substrate bed | ||
| Laminar flow Cabinet | ESCO Laminar Flow Cabinet | Provide as sterile environment during substrate inoculation | |
| Metarhizium pinghaense conidia | Stellenbosch University | 5HEID | Cultures used to mass culture conidia of Metarhizium pinghaense |
| Metarhizium robertsii conidia | Stellenbosch University | 6EIKEN | Cultures used to mass culture conidia of Metarhizium robertsii |
| Microscope | ZEIZZ (Scope. A1) | Used to determine conidial concentrations and conidial viability | |
| Orbital shaker | IncoShake- LABOTEC | Used for the blastospore production process | |
| Parboiled rice | Spekko | Agricultural grain used as a solid substrate growth medium for conidia of both M. pinghaense and M. robertsii | |
| Penicillin-Streptomycin | SIGMA | Added to the SDA medium to prevent bacterial contamination | |
| Petri-dishes | Lasec | Containers for the SDA medium | |
| Pipettes and pipette tips | Labnet (BioPette PLUS) | Used to measure liquids ingredients | |
| Polyvinylchloride Marley waste pipe | Used to create a neck for the fermentation bag | ||
| Potassium phosphate dibasic (K2HPO4) | SIGMA-ALDRICH | Ingredient of the blastospore liquid medium | |
| Rubber band | Used to secure the secure the surgical paper over the fermentation bag PVC pipe necks | ||
| Sabaroud dextrose agar (SDA) | NEOGEN Culture Media | Medium used to culture spores of both Metarhizium pinghaense and Metarhizium robertsii | |
| Sterile distilled water | To hydrate agricultural grains, to make conidial suspensions | ||
| Sticky pad | Used to secure the seives on the vibratory shaker | ||
| Surgical blade | Lasec | Used to scrape off spores from fungal cultures | |
| Surgical paper | Lasec | Used to cover the PVC necks and cotton wool plugs of the fermentation bag | |
| Vibratory shaker | Used to shake conidia off the agricultural grain substrates | ||
| Vortex mixer | Labnet (Labnet International, Inc.) | Used to mix conidial suspensions in Mc Cartney bottles | |
| Yeast extract | Biolab | Added to the SDA medium to improve spore germination and growth | |
| Zipper-lock bags | GLAD | Used to to store harvested fungal conidia |
Riferimenti
- Shah, P. A., Pell, J. K. Entomopathogenic fungi as biological control agents. Applied Microbiology and Biotechnology. 61 (5), 413-423 (2003).
- Mathulwe, L. L., Malan, A. P., Stokwe, N. F. A review of the biology and control of the obscure mealybug, Pseudococcus viburni (Hemiptera: Pseudococcidae), with special reference to biological control using entomopathogenic fungi and nematodes. African Entomology. 29 (1), 1-16 (2020).
- Ibrahim, L., Laham, L., Touma, A., Ibrahim, S. Mass production, yield, quality, formulation and efficacy of entomopathogenic Metarhizium anisopliae conidia. Current Journal of Applied Science and Technology. 9 (5), 427-440 (2015).
- Banu, J. G., Rajalakshmi, S. Standardisation of media for mass multiplication of entomopathogenic fungi. Indian Journal of Plant Protection. 42 (1), 91-93 (2014).
- Roberts, D. W., Humber, R. A., Cole, G. T., Kendrick, W. B. Entomogenous fungi. Biology of Conidial Fungi. , 201-236 (1981).
- Feng, M. G., Poprawski, T. J., Khachatourians, G. G. Production, formulation and application of the entomopathogenic fungus Beauveria bassiana for insect control. Current status. Biocontrol Science and Technology. 4 (1), 3-34 (1994).
- Karanja, L. W., Phiri, N. A., Oduor, G. I. Effect of different solid substrates on mass production of Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae entomopathogens. The Proceedings of the12th KARI Biennial Scientific Conference. , 8-12 (2010).
- Prasad, C. S., Pal, R. Mass production and economics of entomopathogenic fungus, Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae and Verticillium lecanii on agricultural and industrial waste. Scholars Journal of Agriculture and Veterinary Sciences. 1 (1), 28-32 (2014).
- Ehlers, R. U. Mass production of entomopathogenic nematodes for plant protection. Applied Microbiology and Biotechnology. 56 (5), 623-633 (2001).
- Pham, T. A., Kim, J. J., Kim, S. G., Kim, K. Production of blastospore of entomopathogenic Beauveria bassiana in a submerged batch culture. Mycobiology. 37 (3), 218-224 (2009).
- Bhadauria, B. P., Puri, S., Singh, P. K. Mass production of entomopathogenic fungi using agricultural products. The Bioscan. 7 (2), 229-232 (2012).
- Latifian, M., Rad, B., Amani, M. Mass production of entomopathogenic fungi Metarhizium anisopliae by using agricultural products based on liquid-solid diphasic method for date palm pest control. International Journal of Farming and Allied Sciences. 3 (4), 368-372 (2014).
- Agale, S. V., Gopalakrishnan, S., Ambhure, K. G., Chandravanshi, H., Gupta, R., Wani, S. P. Mass production of entomopathogenic fungi (Metarhizium anisopliae) using different grains as a substrate. International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences. 7 (1), 2227-2232 (2018).
- Jackson, M. A. Optimizing nutritional conditions for the liquid culture production of effective fungal biological control agents. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 19 (3), 180-187 (1997).
- Deshpande, M. V. Mycopesticides production by fermentation. Potential and challenges. Critical Reviews in Microbiology. 25 (3), 229-243 (1999).
- Sahayaraj, K., Namasivayam, S. K. R. Mass production of entomopathogenic fungi using agricultural products and by products. African Journal of Biotechnology. 7 (12), 1907-1910 (2008).
- Feng, K. C., Liu, L. B., Tzeng, Y. M. Verticillium lecanii spore production in solid-state and liquid-state fermentations. Bioprocess Engineering. 23 (1), 25-29 (2000).
- Jaronski, S. T., Jackson, M. A., Lacey, L. A. Mass production of entomopathogenic Hypocreales. Manual of Techniques in Invertebrate Pathology 2nd edition. , 255-284 (2012).
- Vega, F. E., Jackson, M. A., Mercandier, G., Poprawski, T. J. The impact of nutrition on spore yields for various fungal entomopathogens in liquid culture. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 19 (4), 363-368 (2003).
- El Damir, M. Effect of growing media and water volume on conidial production of Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae. Journal of Biological Sciences. 6 (2), 269-274 (2006).
- Pandey, A. K., Kanaujia, K. R. Effect of different grains as solid substrates on sporulation, viability and pathogenicity of Metarhizium anisopliae (Metschnikoff) Sorokin. Journal of Biological Control. 22 (2), 369-374 (2008).
- Kassa, A., et al. Whey for mass production of Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae. Mycological Research. 112 (5), 583-591 (2008).
- Sharma, S., Gupta, R. B. L., Yadavam, C. P. S. Selection of a suitable medium for mass multiplication of entomofungal pathogens. Indian Journal of Entomology. 64 (3), 254-261 (2002).
- Bich, G. A., Castrillo, M. L., Villalba, L. L., Zapata, P. D. Evaluation of rice by-products, incubation time, and photoperiod for solid state mass multiplication of the biocontrol agents Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae. Agronomy Research. 16 (5), 1921-1930 (2018).
- Price, R. E., Müller, E. J., Brown, H. D., D’Uamba, P., Jone, A. A. The first trial of a Metarhizium anisopliae var. acridum mycoinsecticide for the control of the red locust in a recognised outbreak area. International Journal of Tropical Insect Science. 19 (4), 323-331 (1999).
- Hatting, J. L., Moore, S. D., Malan, A. P. Microbial control of phytophagous invertebrate pests in South Africa. Current status and future prospects. Journal of Invertebrate Pathology. 165, 54-66 (2019).
- Mathulwe, L. L., Malan, A. P., Stokwe, N. F. Laboratory screening of entomopathogenic fungi and nematodes for pathogenicity against the obscure mealybug, Pseudococcus viburni (Hemiptera: Pseudococcidae). Biocontrol Science and Technology. , (2021).
- Inglis, G. D., Enkerli, J., Goettel, M. S. Laboratory techniques used for entomopathogenic fungi: Hypocreales. Manual of Techniques in Invertebrate Pathology. , 189-253 (2012).
- Mehta, J., et al. Impact of carbon & nitrogen sources on the Trichoderma viride (Biofungicide) and Beauveria bassiana (entomopathogenic fungi). European Journal of Experimental Biology. 2 (6), 2061-2067 (2012).
- Burges, H. D. Formulation of mycoinsecticides. Formulation of Microbial Biopesticides. , 131-185 (1998).
