Producción en masa de hongos entomopatógenos, Metarhizium robertsii y Metarhizium pinghaense, para aplicación comercial contra plagas de insectos

Summary

Los hongos entomopatógenos han ganado importancia como agentes de control biológico de plagas de insectos agrícolas. En este estudio, la producción en masa de un número suficiente de propágulos infecciosos resistentes de aislados sudafricanos de Metarhizium robertsii y M. pinghaense para su aplicación comercial contra plagas de insectos se llevó a cabo con éxito utilizando productos de granos agrícolas.

Abstract

Los hongos entomopatógenos del complejo de especies Metarhizium anisopliae han ganado importancia como agentes de control biológico de plagas de insectos agrícolas. El aumento de la resistencia de las plagas a los insecticidas químicos, las crecientes preocupaciones con respecto a los efectos negativos de los insecticidas en la salud humana y la contaminación ambiental causada por los plaguicidas han llevado a un impulso mundial para encontrar nuevas estrategias sostenibles para la protección de cultivos y el control de plagas. Anteriormente, se han realizado intentos de cultivo masivo de especies de hongos entomopatógenos (EPF) como Beauveria bassiana . Sin embargo, solo se han realizado intentos limitados para el cultivo masivo de Metarhizium robertsii y M. pinghaense para su uso contra plagas de insectos. Este estudio tuvo como objetivo producir en masa un número suficiente de propágulos infecciosos resistentes de aislados sudafricanos de M. robertsii y M. pinghaense para su aplicación comercial. Se utilizaron tres productos de granos agrícolas, avena en copos, cebada en copos y arroz, como sustratos de fermentación sólida EPF. Se utilizaron dos métodos de inoculación, suspensiones conidiales y el cultivo fúngico líquido de blastosporas para inocular los sustratos sólidos. Se observó que la inoculación mediante suspensiones conidiales era relativamente menos efectiva, ya que se observaron mayores niveles de contaminación en los sustratos sólidos en relación con el uso del método de inoculación de blastosporas. Se encontró que la avena en escamas no era un sustrato de crecimiento adecuado tanto para M. robertsii como para M. pinghaense, ya que no se cosecharon conidios secos del sustrato. Se encontró que la cebada en escamas favorecía la producción de M. robertsii conidia sobre la de M. pinghaense, y se cosechó un promedio de 1,83 g ± 1,47 g de M. robertsii conidia seca y cero gramos de M. pinghaense conidia del sustrato. Se encontró que los granos de arroz favorecen la producción en masa conidial de los aislados de M. pinghaense y M. robertsii , con un promedio de 8,2 g ± 4,38 g y 6 g ± 2 g cosechados del sustrato, respectivamente.

Introduction

Los hongos entomopatógenos (EPF) han ganado importancia como agentes protectores de cultivos en el control biológico de importantes plagas de insectos agrícolas ^1,2. Los entomopatógenos, que se producen de forma natural en el suelo, causan epizootias en las poblaciones de diversas especies de plagas³. Las especies de EPF son específicas del huésped y plantean relativamente pocos riesgos en términos de atacar a especies no objetivo, y no son tóxicas para el medio ambiente⁴. Los EPF tienen un mecanismo único para invadir su huésped, así como para propagarse y persistir en su entorno inmediato¹. Atacan al huésped principalmente a través de esporas asexuales que se adhieren y penetran en la cutícula del huésped para invadir y proliferar en el hemocoel del huésped. El huésped finalmente muere debido al agotamiento de los nutrientes de la hemolinfa o como resultado de la toxemia causada por los metabolitos tóxicos liberados por el hongo. Después de la muerte, en condiciones ambientales ideales, el hongo emerge en la superficie externa (micosis manifiesta) del cadáver huésped ^5,6.

La creciente preocupación por los efectos negativos de los residuos químicos en la salud humana, la contaminación ambiental y el desarrollo de resistencia a las plagas ha llevado a la campaña mundial para reducir los insumos de insecticidas de base química y encontrar estrategias alternativas, novedosas y sostenibles para la protección de cultivos y el control de plagas ^6,7,8 . Esto ha brindado oportunidades para desarrollar insecticidas a base de microbios para su uso en programas de Manejo Integrado de Plagas (MIP), que son estrategias ecológicamente más favorables que el control químico convencional ^3,8.

Para desarrollar un agente de control microbiano exitoso para una plaga agrícola, primero se debe aislar, caracterizar, identificar y confirmar su patogenicidad para la plaga objetivo. Sin embargo, se requiere un método fácil y rentable para la producción a gran escala del agente microbiano para producir un producto viable para su uso en programas de control biológico 9,10,11,12,13. La producción en masa de cantidades sustanciales de entomopatógenos de buena calidad depende de la cepa microbiana, el medio ambiente, la plaga objetivo, la formulación, el mercado, la estrategia de aplicación y el producto final deseado 14,15,16. EPF se puede producir en masa utilizando la fermentación de sustrato líquido para producir blastosporas o el proceso de fermentación de sustrato sólido para producir conidios aéreos ^6,17,18. Sin embargo, el proceso de producción y formulación en masa de entomopatógenos influye directamente en la virulencia, el costo, la vida útil y la eficacia de campo del producto final. Para un uso exitoso en MIP, el proceso de producción de los entomopatógenos debe ser fácil de ejecutar, requerir mano de obra mínima, producir una concentración de alto rendimiento de propágulos virulentos, viables y persistentes, y ser de bajo costo 4,13,14,16.

Comprender los requerimientos nutricionales de los entomopatógenos es importante para el cultivo masivo con todos los métodos de cultivo ^4,12. Los componentes nutricionales del medio de producción tienen un impacto significativo en los atributos de los propágulos resultantes, incluyendo la eficacia del biocontrol, el rendimiento, la tolerancia a la desecación y la persistencia 8,19,20,21. La optimización de los procedimientos de producción está diseñada para abordar estos factores²². Para la EPF, los principales requisitos para un buen crecimiento, esporulación y producción en masa de conidios fúngicos son la humedad adecuada, la temperatura óptima de crecimiento, el pH, el intercambio gaseoso de CO₂ y O_2, y la nutrición, incluidas las buenas fuentes de fósforo, carbohidratos, carbono y nitrógeno¹⁸.

Jaronski y Jackson¹⁸ describen el método de fermentación de sustrato sólido como el método de aproximación más eficiente y más cercano al proceso natural para la producción de EPF en relación con el método de fermentación de sustrato líquido porque, en condiciones naturales, el conidio fúngico se transmite sobre estructuras erectas sólidas, como la superficie de los cadáveres de insectos. Los productos agrícolas y los subproductos que contienen almidón se utilizan principalmente para la producción en masa de hongos hipocreales, ya que los hongos descomponen fácilmente el almidón a través de la secreción de enzimas hidrolíticas altamente concentradas de sus puntas hifales, para penetrar en la sustancia sólida y acceder a los nutrientes presentes en la sustancia 11,17,18,23 . Los productos de grano también proporcionan los requisitos para una producción saludable de biomasa porque, cuando se hidratan y esterilizan, los sustratos pueden absorber más nutrientes de cualquier medio líquido 16,18,24.

Anteriormente, varios estudios intentaron cultivar en masa especies de EPF como Beauveria bassiana (Bals). Vuil., Cordyceps fumosorosea (Wize) Kelper B. Shrestha & Spatafora, Verticillium lecanii (Zimm.) Viegas y algunos de los Metarhizium anisopliae (Metschn.) El complejo de especies de Sorokin se aísla sobre diversos sustratos 16,23,24. Tales aislados producidos en masa y desarrollados comercialmente incluyen Green Muscle^® (cepa IMI 330189), desarrollado a partir de M. anisopliae var Metarhizium acridum (Driver & Milner) J.F. Bisch, Rehner & Humber, Metarhizium 69 (Meta 69 cepa ICIPE69), y Real Metarhizium 69 (L9281), desarrollado a partir de M. anisopliae, y Broadband^® (cepa PPRI 5339) y Eco-Bb^®, desarrollado a partir de B. bassiana^25,26 . Sin embargo, se han hecho intentos limitados para el cultivo de masas Metarhizium robertsii J.F. Bisch., S.A. Rehner & Humber y Metarhizium pinghaense Chen & Guo. Estos dos aislados fueron seleccionados en un estudio previo como los más efectivos para el control de la cochinilla, Pseudococcus viburni Signoret (Hemiptera: Pseudococcidae)²⁷. Por lo tanto, el estudio actual tuvo como objetivo formular y producir en masa un número suficiente de propágulos infecciosos resistentes de los aislados locales de M. robertsii y M. pinghaense para su aplicación comercial contra plagas de insectos. El método de fermentación de sustrato sólido se utilizó para producir en masa los conidios fúngicos para ambos aislados de EPF. Se utilizaron dos métodos de inoculación de EPF, utilizando suspensiones conidiales y el cultivo fúngico líquido de blastosporas, para inocular los sustratos sólidos.

Protocol

1. Fuente de cepas fúngicas Utilice cepas fúngicas aisladas sudafricanas de M. pinghaense 5 HEID (número de acceso de GenBank: MT367414/MT895630) y M. robertsii 6EIKEN (MT378171/MT380849), recolectadas de huertos de manzanas en la provincia occidental del Cabo, Sudáfrica. Cultivar cultivos de cada aislado de EPF en 60 g de medio de agar dextrosa Sabouraud, complementado con 1 g de extracto de levadura (SDAY) y 10 μL de estreptomicina.NOTA: Incubar c…

Representative Results

Se observó una disminución en la masa de contenido de los cultivos de arroz tanto para el M. pinghaense como para el M. robertsii a lo largo del tiempo durante la etapa de secado de los cultivos de hongos, sin que se observara ningún cambio o poco en la masa una vez que los cultivos estaban secos (Figura 5). El polvo de conidios fúngicos secos cosechados tanto del M. pinghaense como del M. robertsii se muestra en la Figura 6</stron…

Discussion

La integración exitosa de agentes microbianos para el control biológico de importantes plagas de insectos agrícolas en un agroecosistema depende tanto del éxito como de la facilidad de producción en masa de los entomopatógenos como primer paso en condiciones de laboratorio. La producción en masa de EPF es importante para la aplicación a gran escala y la disponibilidad de productos EPF para programas de MIP utilizando control biológico 9,10,11,12,13.^…

Materials

0.05% Tween 20	Lasec		Added to conidial suspensions to allow fungal spores to mix with water
20 mL McCartney bottles	Lasec		Used to make conidial suspensions
Aluminium foil			Used as a cover of the cotton wool plugs on 250-mL flask
Autoclave			Used to sterilize materials and ingredients used for the conidia production process
Autoclave bags	Lasec		Fermentation bags or solid substrate containers
Autoclave tape	Lasec		To secure PVC pipes on the fermentation bags
Brown Kraft paper bags			Used to dry conidia cultures on agricultural grains
Bunsen burnner	Labnet (Labnet International, Inc.)		Used to flame equipment (surgical blades,inoculating loops and rims of flasks)
Clear edge test sieve			Used to separate fungal conidia from agricultural grain substrates
Corn steep liquor	SIGMA	66071-94-1	Ingredient of the blastospore liquid medium
Cotton Wool	Lasec		Used as plug of the neck for fermentation bags
Duran laboratory bottles	Neolab		Used to autoclave SDA medium and distilled water
Electrical tape			Used to tape and seal the sieve joints to prevent the escape of conidial dust
ENDECOTTS test sieve			Used to separate fungal conidia from agricultural grain substrates
Erlenmeyer Flasks, Narrow neck,250-mL flask	Lasec		Carrier of the blastospore liquid medium
Ethanol (99%)	Lasec		Used to sterilize surgical blades and inoculating loops
Flaked barley	Health Connection Wholefoods		Agricultural grain used as a solid substrate growth medium for conidia of both M. pinghaense and M. robertsii
Flaked oats	Tiger brands		Agricultural grain used as a solid substrate growth medium for conidia of both M. pinghaense and M. robertsii
Glucose	Merck		Ingredient of the blastospore liquid medium
Growth Chamber/ incubators			For growing fungal conidia culture
Haemocytometer			Used to determine conidial concentrations
Inoculating loops	Lasec		For harvesting spores to innoculate liquid medium for blastospores growth
Kitchen rolling pin			Used to manipulate the solid grain substrate bed
Laminar flow Cabinet	ESCO Laminar Flow Cabinet		Provide as sterile environment during substrate inoculation
Metarhizium pinghaense conidia	Stellenbosch University	5HEID	Cultures used to mass culture conidia of Metarhizium pinghaense
Metarhizium robertsii conidia	Stellenbosch University	6EIKEN	Cultures used to mass culture conidia of Metarhizium robertsii
Microscope	ZEIZZ (Scope. A1)		Used to determine conidial concentrations and conidial viability
Orbital shaker	IncoShake- LABOTEC		Used for the blastospore production process
Parboiled rice	Spekko		Agricultural grain used as a solid substrate growth medium for conidia of both M. pinghaense and M. robertsii
Penicillin-Streptomycin	SIGMA		Added to the SDA medium to prevent bacterial contamination
Petri-dishes	Lasec		Containers for the SDA medium
Pipettes and pipette tips	Labnet (BioPette PLUS)		Used to measure liquids ingredients
Polyvinylchloride Marley waste pipe			Used to create a neck for the fermentation bag
Potassium phosphate dibasic (K2HPO4)	SIGMA-ALDRICH		Ingredient of the blastospore liquid medium
Rubber band			Used to secure the secure the surgical paper over the fermentation bag PVC pipe necks
Sabaroud dextrose agar (SDA)	NEOGEN Culture Media		Medium used to culture spores of both Metarhizium pinghaense and Metarhizium robertsii
Sterile distilled water			To hydrate agricultural grains, to make conidial suspensions
Sticky pad			Used to secure the seives on the vibratory shaker
Surgical blade	Lasec		Used to scrape off spores from fungal cultures
Surgical paper	Lasec		Used to cover the PVC necks and cotton wool plugs of the fermentation bag
Vibratory shaker			Used to shake conidia off the agricultural grain substrates
Vortex mixer	Labnet (Labnet International, Inc.)		Used to mix conidial suspensions in Mc Cartney bottles
Yeast extract	Biolab		Added to the SDA medium to improve spore germination and growth
Zipper-lock bags	GLAD		Used to to store harvested fungal conidia