Protokollen præsenterer en række bedste praksisprotokoller til indsamling af knoglepulver fra otte anbefalede anatomiske prøveudtagningssteder (specifikke placeringer på et givet skeletelement) på tværs af fem forskellige skeletelementer fra middelalderlige individer (radiocarbon dateret til en periode på ca. 1040-1400 CE, kalibreret 2-sigma-område).
De metoder, der præsenteres her, søger at maksimere chancerne for genopretning af menneskeligt DNA fra gamle arkæologiske rester, samtidig med at inputprøvemateriale begrænses. Dette blev gjort ved at målrette anatomiske prøveudtagningssteder, der tidligere var bestemt til at give de højeste mængder gammelt DNA (aDNA) i en sammenlignende analyse af DNA-genopretning på tværs af skelettet. Tidligere forskning har antydet, at disse protokoller maksimerer chancerne for en vellykket genopretning af gammelt humant og patogen DNA fra arkæologiske rester. DNA-udbytter blev tidligere vurderet af Parker et al. 2020 i en bred undersøgelse af aDNA-bevarelse på tværs af flere skeletelementer fra 11 individer, der blev genvundet fra middelalderen (radiocarbon dateret til en periode på ca. (ca.) 1040-1400 CE, kalibreret 2-sigma-rækkevidde) kirkegård ved Krakauer Berg, en forladt middelalderlig bosættelse nær Peißen Tyskland. Disse otte prøvetagningssteder, der spænder over fem skeletelementer (pars petrosa, permanente molarer, brysthvirvel, distal falanks og talus) gav med succes gammel menneskelig DNA af høj kvalitet, hvor udbyttet var signifikant større end det samlede gennemsnit på tværs af alle elementer og individer. Udbyttet var tilstrækkeligt til brug i de fleste almindelige nedstrøms populationsgenetiske analyser. Vores resultater understøtter præferenceanvendelsen af disse anatomiske prøvetagningssteder til de fleste undersøgelser, der involverer analyser af gammelt menneskeligt DNA fra arkæologiske rester. Implementering af disse metoder vil bidrage til at minimere ødelæggelsen af dyrebare arkæologiske prøver.
Prøveudtagningen af gamle menneskelige rester med henblik på DNA-genopretning og analyse er i sagens natur ødelæggende 1,2,3,4. Prøverne i sig selv er dyrebare prøver, og morfologisk konservering bør bevares, hvor det er muligt. Som sådan er det bydende nødvendigt, at prøveudtagningspraksis optimeres for både at undgå unødvendig ødelæggelse af uerstatteligt materiale og for at maksimere sandsynligheden for succes. De nuværende teknikker for bedste praksis er baseret på en lille kohorte af undersøgelser, der er begrænset til enten retsmedicinske undersøgelser5,6, undersøgelser af gamle prøver, hvor udviklingen af optimal prøveudtagning ikke er det direkte mål med undersøgelsen7, eller dedikerede undersøgelser, der anvender enten ikke-menneskelige rester8 eller er rettet mod et meget lille udvalg af anatomiske prøveudtagningssteder (bruges her til at betegne et specifikt område af et skeletelement, hvorfra knoglepulver, til brug i downstream-DNA-analyser, blev genereret)9,10. Prøveudtagningsprotokollerne, der præsenteres her, blev optimeret i den første store systematiske undersøgelse af DNA-bevarelse på tværs af flere skeletelementer fra flere individer11. Alle prøver stammede fra skeletelementer, der blev fundet fra 11 personer udgravet fra kirkegården i den forladte middelalderlige bosættelse Krakauer Berg nær Peißen, Sachsen-Anhalt, Tyskland (se tabel 1 for detaljeret prøvedemografi) og kan som sådan have brug for ændring til brug med prøver uden for dette geografiske / tidsmæssige interval.
Individuel | Køn | Anslået alder ved død | 14 C datoer (CE, Cal 2-sigma) |
KRA001 | Mandlig | 25-35 | 1058-1219 |
KRA002 | Kvindelig | 20-22 | 1227-1283 |
KRA003 | Mandlig | 25 | 1059-1223 |
KRA004 | Mandlig | 15 | 1284-1392 |
KRA005 | Mandlig | 10-12 | 1170-1258 |
KRA006 | Kvindelig | 30-40 | 1218-1266 |
KRA007 | Kvindelig | 25-30 | 1167-1251 |
KRA008 | Mandlig | 20 | 1301-1402 |
KRA009 | Mandlig | Ukendt | 1158-1254 |
KRA010 | Mandlig | 25 | 1276-1383 |
KRA011 | Kvindelig | 30-45 | 1040-1159 |
Tabel 1: Genetisk bestemt køn, arkæologisk bestemt estimeret alder ved død og radiokarbondatering (14C Cal 2-sigma) for alle de 11 personer, der er udtaget. Denne tabel er tilpasset fra Parker, C. et al. 202011.
Disse protokoller giver mulighed for en relativt ligetil og effektiv generering af knoglepulver fra otte anatomiske prøvetagningssteder på tværs af fem skeletelementer (inklusive pars petrosa) med begrænset laboratorieinduceret DNA-kontaminering. Af disse fem skeletelementer er syv anatomiske prøveudtagningssteder fundet på fire skeletelementer blevet bestemt til at være levedygtige alternativer til den destruktive prøveudtagning af petrouspyramiden11,12. Disse omfatter cementum, dentin og pulpkammer af permanente molarer; kortikal knogle indsamlet fra det overlegne ryghvirvelhak såvel som fra kroppen af brysthvirvler; kortikal knogle, der stammer fra den ringere overflade af den apikale tuft og skaft af de distale phalanges; og den tætte kortikale knogle langs den ydre del af tali. Mens der er flere udbredte metoder til prøveudtagning af pars petrosa 4,12,13,14, dentin og tandmassekammeret 1,2,15, offentliggjorte metoder, der beskriver den vellykkede generering af knoglepulver fra cementum 16 , hvirvellegeme, ringere hvirvelhak og talus kan være vanskelige at opnå. Som sådan demonstrerer vi her optimerede prøveudtagningsprotokoller til petrouspyramiden (trin 3.1); cementum (trin 3.2.1), dentin (trin 3.2.2) og tandmasse (trin 3.2.3) af voksne molarer; kortikal knogle i rygsøjlen (trin 3.3.1) og overlegen ryghvirvelbue (trin 3.3.2) den distale falanks (trin 3.4); og talus (trin 3.5) for at gøre effektiv anvendelse af disse skeletelementer til både aDNA og retsmedicinsk forskning mere tilgængelig.
Nuværende praksis inden for gammel human populationsgenetik er fortrinsvis at prøve fra pars petrosa (trin 2.1), når det er muligt. Pars petrosa kan dog være en vanskelig prøve at opnå, da den er højt værdsat for et utal af skeletvurderinger (f.eks. Befolkningshistorie32, estimering af fosteralder veddød 33 og kønsbestemmelse34), og historisk set kan prøveudtagning af pars petrosa til DNA-analyse være meget destruktiv3,4 (inklusive protokollen præsenteret her, selvom nye, minimalt invasive protokoller13,14 nu er blevet bredt vedtaget for at afhjælpe denne bekymring). Dette forstærkes af det faktum, at der indtil for nylig ikke var forsøgt en storstilet, systematisk undersøgelse af menneskelig DNA-genopretning på tværs af skelettet11, hvilket gør det udfordrende at finde en passende prøveudtagningsstrategi, når petrouspyramiden ikke er tilgængelig.
De protokoller, der præsenteres her, hjælper med at afhjælpe denne udfordring ved at tilvejebringe et sæt optimerede procedurer for DNA-prøveudtagning fra arkæologiske / retsmedicinske skeletrester, herunder pars petrosa samt syv alternative anatomiske prøveudtagningssteder på tværs af fire yderligere skeletelementer. De omfattede kritiske trin har alle til formål at minimere risikoen for DNA-tab/-beskadigelse som følge af enten ineffektiv prøveudtagning (trin 2.1.6 og 3.2.1.3) eller overophedning af prøver under boring/skæring (trin 3.1.6). Derudover er det blevet bemærket i hele protokollen, at det kan være nødvendigt at ændre/udelade forbehandlingstrinnene for at sikre den bedste ydeevne i stærkt nedbrudte prøver. Det skal også bemærkes, at selv blandt de udvalgte elementer, der præsenteres her, er der stadig flere mulige alternative prøveudtagningsteknikker (især for pars petrosa13,14) samt rigelig plads til yderligere optimering af de underudnyttede anatomiske prøveudtagningssteder, der præsenteres her (dvs. talus: trin 2.5 og hvirvlerne: trin 2.3).
Det er også vigtigt at huske på, at disse protokoller er designet og testet ved hjælp af gamle ungdoms-voksne rester af høj kvalitet (god morfologisk konservering) med henblik på endogene humane DNA-analyser. De fremlagte resultater strækker sig muligvis ikke til mere stærkt nedbrudte materialer, andre bevaringssammenhænge, spædbarnsrester, ikke-menneskelige rester eller undersøgelser af patogener eller mikrobiomet, da der stadig er behov for en større udforskning af brugen af disse protokoller i yderligere sammenhænge. Derudover kan de alternative skeletelementer, der præsenteres her (tænderne, hvirvlerne, distal falanks og tali) være udfordrende at tildele et enkelt individ blandt blandede rester, hvilket kræver prøveudtagning fra flere elementer for at sikre en enkelt oprindelse. På trods af disse begrænsninger kan det at gøre disse protokoller bredt tilgængelige hjælpe med at lindre noget af heterogeniteten omkring prøveudvælgelse og -behandling ved at give en generaliseret og kvantitativt optimeret ramme til brug i en bred vifte af fremtidige aDNA / retsmedicinske undersøgelser af menneskelige rester.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke laboratoriepersonalet på Max Planck Institute for Science of Human History for deres hjælp til udvikling og implementering af disse protokoller. Dette arbejde ville ikke have været muligt uden input og hårdt arbejde fra Dr. Guido Brandt, Dr. Elizabeth Nelson, Antje Wissegot og Franziska Aron. Denne undersøgelse blev finansieret af Max Planck Society, Det Europæiske Forskningsråd (ERC) under EU’s Horizon 2020 forsknings- og innovationsprogram under tilskudsaftaler nr. 771234 – PALEoRIDER (WH, ABR) og starttilskud nr. 805268 CoDisEASe (til KIB).
#16 Dental Drill Bit | NTI | H1-016-HP | example drilling bit |
0.6 mm scroll saw blade | Fisher Scientific | 50-949-097 | blade for Jewellers Saw |
22mm diamond cutting wheel | Kahla | SKU 806 104 358 514 220 | Dremel cutting attachment |
Commercial Bleach | Fisher Scientific | NC1818018 | |
Control Company Ultra-Clean Supreme Aluminum Foil | Fisher Scientific | 15-078-29X | |
DNA LoBind Tubes (2 mL) | Eppendorf | 22431048 | |
Dremel 225-01 Flex Shaft Attachment | Dremel | 225-01 | Dremel flexible extension |
Dremel 4300 Rotary Tool | Dremel | 4300 | Example drill |
Dremel collet and nut kit | Dremel | 4485 | Adapters for various Dremel tool attachments/bits |
Eagle 33 Gallon Red Biohazard Waste Bag | Fisher Scientific | 17-988-501 | |
Eppendorf DNA LoBind 2 mL microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 13-698-792 | |
Ethanol (Molecular Biology Grade) | Millipore Sigma | 1.08543 | |
FDA approved level 2 Surgical Mask | Fisher Scientific | 50-206-0397 | PPE |
Fisherbrand Comfort Nitrile Gloves | Fisher Scientific | 19-041-171X | PPE |
Fisherbrand Safety Glasses | Fisher Scientific | 19-130-208X | PPE |
Granger Stationary Vise | Fisher Scientific | NC1336173 | benchtop vise |
Invitrogen UltraPure DNase/Rnase free distilled water | Fisher Scientific | 10-977-023 | |
Jewellers Saw | Fisher Scientific | 50-949-231 | |
Kimwipes | Sigma-Aldritch | Z188956 | |
Labconco Purifier Logic Biosafety cabinet | Fisher Scientific | 30-368-1101 | |
LookOut DNA Erase | Millipore Sigma | L9042-1L | |
Medium weighing boat | Heathrow Scientific | HS120223 | |
MSC 10pc plier/clamp set | Fisher Scientific | 50-129-5352 | Miscellaneous clamps/vise grips for securely holding samples while drilling/cutting |
Sartorius Quintix Semi-Micro Balance | Fisher Scientific | 14-560-019 | enclosed balance |
Tyvek coveralls with hood | Fisher Scientific | 01-361-7X | PPE |
Weigh paper | Heathrow Scientific | HS120116 |