यहां प्रस्तुत सभी शोध प्राचीन मानव अवशेषों के साथ काम करने के लिए मैक्स प्लैंक इंस्टीट्यूट फॉर द साइंस ऑफ ह्यूमन हिस्ट्री, जेना, जर्मनी द्वारा निर्धारित दिशानिर्देशों के अनुपालन में किए गए थे। इस प्रोटोकॉल के किसी भी चरण को करने से पहले वैज्ञानिक अध्ययन के लिए अनुमति प्राप्त करने और अपने क्षेत्र में विनाशकारी नमूने के लिए मानव अवशेषों के उपयोग से संबंधित सभी स्थानीय / राज्य / संघीय नैतिक आवश्यकताओं का पालन करना सुनिश्चित करें। रासायनिक भंडारण व्यक्तिगत संस्थागत सुरक्षा दिशानिर्देशों के अनुसार किया जाना चाहिए। 1. नमूना प्रसंस्करण से पहले विचार प्राचीन अवशेषों के रूप में देखभाल के साथ नमूनों का इलाज करना एक अपरिवर्तनीय और परिमित संसाधन है (उदाहरण के लिए, नमूनाकरण जितना संभव हो उतना कम से कम बेकार होना चाहिए, और यदि संभव हो तो सभी अवशेष अपने संबंधित और वैध प्रदाताओं को वापस कर दिए जाने चाहिए)। एक स्वच्छ कमरे के वातावरण में सभी चरणों का प्रदर्शन करें, अधिमानतः एक समर्पित प्राचीन डीएनए सुविधा 17,18,19 पर। व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (पीपीई) का उपयोग करें जिसमें हुड के साथ बाँझ माइक्रोपोरस कवरऑल, बाँझ दस्ताने (दो जोड़े), सर्जिकल मास्क, सुरक्षात्मक चश्मा, और बाँझ जूते या बाँझ कवर के साथ गैर-स्लिप जूते शामिल हैं (सामग्री की तालिका देखें)। दस्ताने को अक्सर बदलें, खासकर नमूनों के बीच। सभी उपकरणों और सतहों को ब्लीच / डीएनए परिशोधन समाधान / इथेनॉल और यूवी विकिरण (तरंग दैर्ध्य: 254 एनएम) के साथ अच्छी तरह से साफ और कीटाणुरहित करें (उदाहरण के लिए, ड्रिल बिट्स, ड्रिल, विस / क्लैंप, आदि)। अंत में, साफ कमरे के वातावरण के कारण अति-थकावट से बचने के लिए नियमित एर्गोनोमिक ब्रेक (यदि संभव हो तो हर 2-3 घंटे) लेने की अत्यधिक अनुशंसा की जाती है।नोट: नमूना लेने से पहले सभी कंकाल अवशेषों को उचित रूप से प्रलेखित किया जाना चाहिए (उदाहरण के लिए, फोटो खिंचवाना, वजन करना, और यदि संभव हो तो माइक्रो-सीटी स्कैन, 3 डी इमेज, आदि) (उपयुक्त प्रलेखन के लिए प्रोटोकॉल इस पांडुलिपि में शामिल नहीं हैं)। सभी नमूना प्रोटोकॉल को नमूना पुनरावृत्तियों के बीच रोका जा सकता है और नमूनों को शुष्क, तापमान नियंत्रित (25 डिग्री सेल्सियस), बाँझ वातावरण में अनिश्चित काल तक संग्रहीत किया जा सकता है। 2. पूर्व-उपचार संदूषण के जोखिम को कम करने के लिए हड्डी पाउडर उत्पादन से पहले सभी शारीरिक नमूना स्थानों को अलग करें।नोट: नमूना परिशोधन के लिए ब्लीच और / या सतह हटाने की प्रभावकारिता (सतह हटाने के चरणों के लिए चरण 3.3.2 में नोट देखें) अभी भी एडीएनए शोधकर्ताओं 8,19,20,21,22,23,24,25 के बीच बहस का विषय है क्योंकि दोनों समग्र डीएनए पैदावार को प्रभावित कर सकते हैं, खासकर अत्यधिक अवक्रमित नमूनों में। जैसे, निम्नलिखित चरणों को वैकल्पिक माना जाता है और यहां शामिल किया जाता है क्योंकि उनका उपयोग इस पेपर में प्रस्तुत प्रतिनिधि परिणामों को उत्पन्न करने के लिए सभी नमूनों में किया गया था। यह अनुशंसा की जाती है कि इन पूर्व-उपचार प्रोटोकॉल का उपयोग आणविक अनुप्रयोग, आयु, दुर्लभता और प्रत्येक नमूना सेट के रूपात्मक गिरावट के स्तर के आधार पर मामला-दर-मामला आधार पर निर्धारित किया जाए।एयरफ्लो बंद होने के साथ यूवी लाइट से लैस पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) हुड या बायोसेफ्टी कैबिनेट के तहत एक समर्पित साफ कमरे में सभी नमूने करें। किसी भी आवारा हड्डी पाउडर / टुकड़ों को पकड़ने के लिए बेंचटॉप पर बाँझ एल्यूमीनियम पन्नी फैलाएं। सुनिश्चित करें कि पन्नी के निपटान से पहले हड्डी के सभी टुकड़े बरामद किए गए हैं (प्रत्यावर्तन के लिए)। प्रत्येक कंकाल तत्व के उपचार के बीच पन्नी बदलें। इस्तेमाल की गई पन्नी को एक आटोक्लेवेबल बायोहाजार्ड बैग/रिसेप्टेकल में रखें। शारीरिक नमूना स्थानों से जितना संभव हो उतना ढीली गंदगी / डिट्रिटस को हटा दें, धीरे से एक लिंट-मुक्त शुष्क बाँझ पोंछे के साथ क्षेत्र को पोंछकर ( सामग्री की तालिका देखें)। आटोक्लेवेबल बायोहाजार्ड बैग या रिसेप्टेकल्स में वाइप्स का निपटान करें। पतला वाणिज्यिक ब्लीच (~ 0.01% v/v, अल्ट्राप्योर DNase/RNase मुक्त पानी से पतला) के साथ गीले बाँझ पोंछे से पोंछकर साफ की गई सतह को दूषित करें और 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करने की अनुमति दें। आटोक्लेवेबल बायोहाजार्ड बैग या रिसेप्टेकल्स में वाइप्स का निपटान करें।चेतावनी: ब्लीच एक अत्यधिक संक्षारक और प्रतिक्रियाशील रसायन है; इसलिए इसके उपयोग से पहले उचित सुरक्षा सावधानियां बरती जानी चाहिए। अल्ट्राप्योर डीनेस/आरएनएस-मुक्त पानी से नम बाँझ पोंछे के साथ शारीरिक नमूना स्थान से जितना संभव हो उतना अवशिष्ट ब्लीच निकालें। आटोक्लेवेबल बायोहाजार्ड बैग या रिसेप्टेकल्स में वाइप्स का निपटान करें। 30 मिनट (तरंगदैर्ध्य: 254 एनएम) के लिए यूवी विकिरण के लिए सभी साफ शारीरिक नमूना स्थानों को उजागर करें, और फिर कमरे के तापमान पर पूरी तरह से सूखने की अनुमति दें। सुनिश्चित करें कि नमूनाकरण के साथ आगे बढ़ने या भंडारण पर लौटने से पहले शारीरिक नमूना स्थान पूरी तरह से सूख गए हैं ताकि न केवल हड्डी पाउडर उत्पादन आसान हो सके, बल्कि नमूने के आगे के क्षरण को भी रोका जा सके (जैसे, मोल्ड)।सावधानी: यूवी विकिरण के संपर्क में आंखों के लिए हानिकारक हो सकता है। सूखे, तापमान नियंत्रित (25 डिग्री सेल्सियस) बाँझ वातावरण में कंकाल तत्वों को नमूना लेने या संग्रहीत करने के लिए तुरंत जाएं। 3. हड्डी पाउडर उत्पादन नोट: निम्नलिखित प्रोटोकॉल डबनी एट अल 2019 प्रोटोकॉल26 के बाद डीएनए निष्कर्षण में उपयोग के लिए अभिप्रेत हैं। का नमूना pars petrosaनोट: यह प्रोटोकॉल पिनासी एट अल 2019 में वर्णित प्रक्रियाओं से अनुकूलित है4 और उपयोग में आसानी के लिए यहां प्रस्तुत किया गया है। यह प्रोटोकॉल नमूने के लिए वर्तमान, कम से कम विनाशकारी विधि का प्रतिनिधित्व नहीं करता है pars petrosa. जैसे, सिरक एट अल 2017 द्वारा वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है।13 या ऑर्फानो एट अल।14 नमूनों के लिए जहां रूपात्मक संरक्षण अधिकतम महत्व का है।एयरफ्लो बंद होने के साथ यूवी लाइट से लैस पीसीआर हुड या बायोसेफ्टी कैबिनेट (तरंग दैर्ध्य: 254 एनएम) के तहत एक समर्पित साफ कमरे में सभी नमूने करें। किसी भी आवारा हड्डी पाउडर / टुकड़ों को पकड़ने के लिए बेंचटॉप पर बाँझ एल्यूमीनियम पन्नी फैलाएं। सुनिश्चित करें कि पन्नी के निपटान से पहले सभी हड्डी के टुकड़े और जितना संभव हो उतना पाउडर बरामद किया जाए (प्रत्यावर्तन के लिए)। प्रत्येक नमूने के बीच पन्नी बदलें। इस्तेमाल की गई पन्नी को एक ऑटोक्लेवेबल बायोहाजार्ड बैग / रिसेप्टेकल में निपटाएं। एक निष्फल क्लैंप या विज़ का उपयोग करके सूखे, दूषित तत्व को सुरक्षित करें। ओवरहीटिंग से बचने के लिए मध्यम गति पर 0.6 मिमी ब्लेड (सामग्री की तालिका देखें) से लैस मानक ज्वैलर्स आरी का उपयोग करके बेहतर सल्कस पेट्रोसस (चित्रा 1 देखें) के साथ पार्स पेट्रोसा को आधे में काट लें (चरण 3.1.6 के नीचे नोट देखें)।सावधानी: पार्स पेट्रोसा बहुत घना है, और इस तरह काटना मुश्किल हो सकता है। चोट से बचने के लिए तत्व को सुरक्षित रूप से दबाकर रखने का ध्यान रखें। किसी भी टूटे हुए ब्लेड को उपयुक्त शार्प्स के रिसेप्टेक में निपटाएं। क्लैंप से पेट्रोस भागों को हटा दें। किसी भी ढीली/अतिरिक्त सामग्री को पुनर्प्राप्त करें और बचाएं। बाँझ वजन वाली नाव में वजन कागज रखें वजन कागज के ऊपर पेट्रोस भाग को पकड़ें, वजन ट्रे की ओर झुके हुए किनारे को काटें। चेहरे की नहर और मास्टोइड एंट्रम के बीच घनी कॉर्टिकल हड्डी में ड्रिल करें (आसपास की सामग्री की तुलना में चमकदार प्रतीत होता है, चित्र 1 देखें) एक छोटे गेज बिट ( सामग्री की तालिका देखें) से लैस दंत ड्रिल का उपयोग करें और हड्डी पाउडर का उत्पादन करने के लिए मध्यम गति, मध्यम टोक़ पर सेट करें।नोट: ड्रिलिंग / कटिंग को हड्डी को गर्म करने और संभावित रूप से नष्ट / हानिकारक डीएनए से बचने के लिए कम से मध्यम गति से छोटे विस्फोट में किया जाना चाहिए। उपाख्यानात्मक रूप से, जब पेट्रोस का घना हिस्सा खाना पकाने के बेकन के रूप में वर्णित गंध को अधिक गर्म करना शुरू कर देता है, तो देखा जा सकता है। तुरंत ड्रिलिंग / आरा बंद करें और हड्डी को फिर से शुरू करने से पहले पर्याप्त रूप से ठंडा होने तक आराम करने दें। ड्रिलिंग को तब तक दोहराएं जब तक कि वजन कागज में लगभग 50-100 मिलीग्राम पाउडर एकत्र नहीं किया जाता है, जैसा कि कम से कम 0.01 मिलीग्राम तक सटीक संलग्न संतुलन का उपयोग करके मापा जाता है ( सामग्री की तालिका देखें)।नोट: जहां संभव हो 100 मिलीग्राम हड्डी पाउडर इकट्ठा करने का सुझाव दिया जाता है ताकि प्रत्येक 50 मिलीग्राम के दो प्रतिकृति डीएनए निष्कर्षण की अनुमति मिल सके। हालांकि, यह हमेशा शारीरिक नमूना स्थानों की सीमा (जैसे, डिस्टल फालैंक्स, डेंटल पल्प चैंबर) या रूपात्मक संरक्षण की आवश्यकता के आधार पर संभव नहीं हो सकता है। अन्य स्थानों के लिए, जैसे कि सीमेंटम, 50 मिलीग्राम से काफी कम सामग्री उपलब्ध हो सकती है। हालांकि, निष्कर्षण प्रक्रिया से हड्डी पाउडर के कम प्रारंभिक इनपुट के बावजूद, सीमेंटम, दंत लुगदी कक्ष, और डिस्टल फालैंक्स सभी को महत्वपूर्ण अंतर्जात डीएनए 11,27,28 उत्पन्न करने के लिए दिखाया गया है। निष्कर्षण या भंडारण के लिए वजन कागज से पाउडर को 2 एमएल लेबल वाले कम-बिंद, सुरक्षित-लॉक ट्यूब में स्थानांतरित करें। -20 डिग्री सेल्सियस पर नमूने स्टोर करें, अनिश्चित काल तक। शेष हड्डी / अतिरिक्त पाउडर को सूखे, तापमान नियंत्रित (25 डिग्री सेल्सियस) बाँझ वातावरण में स्टोर करें जब तक कि वापसी / प्रत्यावर्तन पूरा नहीं हो जाता। सभी कचरे को ऑटोक्लेवेबल बायोहाजार्ड बैग या रिसेप्टेकल्स में निपटाएं। प्रत्येक नमूने के बीच ब्लीच/डीएनए परिशोधन समाधान/इथेनॉल और यूवी (तरंगदैर्ध्य: 254 एनएम) एक्सपोजर का उपयोग करके सभी पुन: प्रयोज्य उपकरणों (जैसे, क्लैंप, ड्रिल बिट्स, ड्रिल, आरी, आदि) को निष्फल / चित्र 1: पार्स पेट्रोसा सहित अस्थायी हड्डी। (ए) पेट्रोस पिरामिड और सल्कस पेट्रोसा के स्थानों को दर्शाते हुए नमूना पूर्व-कटाई। (ख) पेट्रोस भाग कटाई के बाद सघन क्षेत्रों को उजागर करना। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। स्थायी दाढ़ का नमूनानोट: स्थायी दाढ़ के नमूने के लिए, पूर्व-चयन करें in situ फ्यूज्ड जड़ों वाले दाढ़ और आदर्श रूप से क्षरण, तामचीनी में दरारें, या सर्वोत्तम परिणामों के लिए अत्यधिक घिसने से रहित होते हैं। किसी भी दंत पथरी के नमूने को हटा दें और मौखिक माइक्रोबायोम (प्रक्रिया यहां कवर नहीं की गई है) के संभावित भविष्य के विश्लेषण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।सीमेंटम का नमूनाएयरफ्लो बंद होने के साथ यूवी लाइट से लैस पीसीआर हुड या बायोसेफ्टी कैबिनेट (तरंग दैर्ध्य: 254 एनएम) के तहत एक समर्पित साफ कमरे में सभी नमूने करें। किसी भी आवारा हड्डी पाउडर / टुकड़ों को पकड़ने के लिए बेंचटॉप पर बाँझ एल्यूमीनियम पन्नी फैलाएं। सुनिश्चित करें कि पन्नी के निपटान से पहले सभी हड्डी के टुकड़े और जितना संभव हो उतना पाउडर बरामद किया गया है (प्रत्यावर्तन के लिए)। प्रत्येक नमूने के बीच पन्नी बदलें। इस्तेमाल की गई पन्नी को एक आटोक्लेवेबल बायोहाजार्ड बैग/रिसेप्टेकल में रखें। वजन कागज की एक शीट को बाँझ वजन ट्रे में रखें। एक समायोज्य रिंच जैसे हाथ से पकड़े गए क्लैंप का उपयोग करके तौल ट्रे के ऊपर तामचीनी द्वारा परिशोधनित दाढ़ को पकड़ें / सुरक्षित करें ( सामग्री की तालिका देखें)। हीरे की धार वाले गोलाकार कटिंग व्हील के साथ एक दंत ड्रिल को लैस करें। ड्रिल को मध्यम गति / टोक़ सेटिंग पर सेट करने के साथ, लगभग -20 ° के कोण पर बिट के किनारे को जड़ तक हल्के से स्पर्श करें। जड़ (सीमेंटम) से पीले, सबसे बाहरी सामग्री को हटाने / इकट्ठा करने के लिए ट्रे में नीचे की ओर खुरचें। जब डेंटिन की हल्की (सफेद) सामग्री दिखाई देती है तो संग्रह बंद कर दें।नोट: पाउडर को एरोसोलाइज्ड होने से बचाने और ट्रे को पूरी तरह से गायब करके नमूने को संभावित रूप से बर्बाद करने से बचने के लिए संग्रह ट्रे के संबंध में कटिंग बिट के रोटेशन की दिशा से मेल खाना महत्वपूर्ण है। सीमेंटम विशेष रूप से डीएनए में समृद्ध है; हालांकि, सामग्री की विशिष्ट पैदावार अन्य शारीरिक नमूना स्थानों (~ 7-20 मिलीग्राम) 11,27,28 की तुलना में बहुत छोटी है। कम से कम 0.01 मिलीग्राम तक सटीक संलग्न संतुलन का उपयोग करके वजन कागज में एकत्र किए गए पाउडर का रिकॉर्ड द्रव्यमान ( सामग्री की तालिका देखें)। निष्कर्षण के लिए वजन कागज से पाउडर को 2 एमएल कम-बिंद, सुरक्षित लॉक ट्यूब में स्थानांतरित करें। -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें, अनिश्चित काल के लिए। लुगदी कक्ष का नमूनासीमेंटम एकत्र होने के बाद (यदि वांछित हो), मुकुट को हटाने के लिए एक जौहरी की आरी का उपयोग करके सीमेंटो-तामचीनी जंक्शन के साथ दाढ़ को खंडित करें ( चित्र 2 देखें)। एक नई वजन ट्रे में वजन कागज की एक नई शीट रखें। वजन ट्रे के ऊपर, क्राउन सेक्शन को हैंडहेल्ड क्लैंप या विस में सुरक्षित करें। कट साइड को नीचे की ओर झुकाएं और ड्रिल /स्क्रैप सामग्री को पहले पास के रूप में क्राउन भाग के भीतर लुगदी कक्ष के किनारों के साथ एक छोटे गेज ड्रिलिंग बिट ( सामग्री की तालिका देखें) से लैस दंत ड्रिल के साथ रखें ( चित्र 2 देखें)।नोट: लुगदी कक्ष के इंटीरियर के केवल पहले पास को एकत्र किया जाना है और लुगदी सामग्री (5-15 मिलीग्राम विशिष्ट उपज) के रूप में लेबल किया जाना है, दांत में गहराई से कुछ भी डेंटिन माना जाता है। दांत को निचले हिस्से के साथ घुमाएं, हथौड़े से क्लैंप को टैप करें, और वजन कागज पर मुक्त पाउडर इकट्ठा करें। कम से कम 0.01 मिलीग्राम के लिए सटीक संलग्न संतुलन का उपयोग करके वजन कागज में एकत्र किए गए पाउडर के वजन को रिकॉर्ड करें ( सामग्री की तालिका देखें)। निष्कर्षण के लिए वजन कागज से पाउडर को 2 एमएल कम-बिंद, सुरक्षित-लॉक ट्यूब में स्थानांतरित करें। -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें, अनिश्चित काल के लिए। डेंटिन का नमूनाएक नई वजन ट्रे में वजन कागज की एक नई शीट रखें। वजन ट्रे (चरण 3.2.2.3 के अनुसार) के ऊपर क्राउन सेक्शन रखें, ड्रिल करें और आगे डेंटिन नमूने के लिए उसी तरह से लुगदी कक्ष के इंटीरियर से 0.01 मिलीग्राम ( सामग्री की तालिका देखें) तक सटीक संलग्न संतुलन का उपयोग करके मापा गया 50-100 मिलीग्राम डेंटिन एकत्र करें ( चित्र 2 देखें)। निष्कर्षण के लिए वजन कागज से हड्डी पाउडर को 2 एमएल कम-बिंद, सुरक्षित-लॉक ट्यूब में स्थानांतरित करें। -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें, अनिश्चित काल के लिए। शेष दांतों के टुकड़ों / अतिरिक्त पाउडर को सूखे, तापमान नियंत्रित (25 डिग्री सेल्सियस) बाँझ वातावरण में स्टोर करें जब तक कि वापसी / प्रत्यावर्तन पूरा नहीं हो जाता। सभी कचरे को ऑटोक्लेवेबल बायोहाजार्ड बैग या रिसेप्टेकल्स में निपटाएं। प्रत्येक नमूने के बीच लागू ब्लीच/डीएनए परिशोधन समाधान/इथेनॉल और यूवी (तरंगदैर्ध्य: 254 एनएम) एक्सपोजर का उपयोग करके सभी पुन: प्रयोज्य उपकरणों (जैसे, क्लैंप, ड्रिल बिट्स, ड्रिल, आरी, आदि) को निष्फल / चित्र 2: स्थायी मोलर पूर्व-नमूनाकरण। (ए) नमूना लेने से पहले पूर्व-उपचारित दाढ़, मुकुट, सीमेंटम (जड़ की पीली परत), और सीमेंटो-तामचीनी जंक्शन पर काटने की जगह को दर्शाता है। (बी) एक ही मोलर पोस्ट-सीमेंटम संग्रह, जो सीमेंटो-तामचीनी जंक्शन पर कट साइट को दर्शाता है। (सी) दाढ़ पोस्ट-कटिंग और नमूनाकरण जो मुकुट के भीतर दंत लुगदी कक्ष और डेंटिन के लिए शारीरिक नमूना स्थानों को दर्शाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। वक्षीय कशेरुकाओं का नमूनाकशेरुक शरीर का नमूनाएयरफ्लो बंद होने के साथ यूवी लाइट से लैस पीसीआर हुड या बायोसेफ्टी कैबिनेट (तरंग दैर्ध्य: 254 एनएम) के तहत एक समर्पित साफ कमरे में सभी नमूने करें। किसी भी आवारा हड्डी पाउडर / टुकड़ों को पकड़ने के लिए बेंचटॉप पर बाँझ एल्यूमीनियम पन्नी फैलाएं। सुनिश्चित करें कि पन्नी के निपटान से पहले सभी हड्डी के टुकड़े और जितना संभव हो उतना पाउडर बरामद किया गया है (प्रत्यावर्तन के लिए)। प्रत्येक नमूने के बीच पन्नी बदलें। इस्तेमाल की गई पन्नी को एक आटोक्लेवेबल बायोहाजार्ड बैग/रिसेप्टेकल में रखें। वजन कागज की एक छोटी शीट को एक मानक वजन ट्रे में रखें। कशेरुका शरीर को बाहर की ओर, क्लैंप या हाथ की छड़ी के साथ सुरक्षित करें। कशेरुका शरीर को नीचे की ओर झुकाकर वजन वाली ट्रे के ऊपर कशेरुका को पकड़ें। कम गति वाले उच्च टोक़ के लिए सेट किए गए एक छोटे गेज ड्रिलिंग बिट ( सामग्री की तालिका देखें) से लैस एक दंत ड्रिल का उपयोग करते हुए, कशेरुक शरीर के कैनसेलस आंतरिक ऊतक के आसपास कॉर्टिकल हड्डी के सबसे बाहरी रिम (अवर और बेहतर) के साथ ड्रिल करें ( चित्र 3 देखें)। एक मानक भार ट्रे पर कॉर्टिकल परत के खिलाफ बिट को तब तक खुरचें जब तक कि 50-100 मिलीग्राम सामग्री एकत्र न हो जाए, जैसा कि 0.01 मिलीग्राम तक सटीक संलग्न संतुलन का उपयोग करके मापा जाता है ( सामग्री की तालिका देखें)। निष्कर्षण के लिए वजन कागज से हड्डी पाउडर को 2 एमएल कम-बिंद, सुरक्षित लॉक ट्यूब में स्थानांतरित करें। -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें, अनिश्चित काल के लिए। बेहतर कशेरुक मेहराब का नमूनानोट: यह चरण वैकल्पिक है। सतह19 के साथ स्क्रैप करके एक छोटे गेज ड्रिलिंग बिट (सामग्री की तालिका देखें) से लैस दंत ड्रिल का उपयोग करके बेहतर कशेरुक मेहराब की कॉर्टिकल हड्डी की सबसे बाहरी परत को हटा दें और छोड़ दें। यह कशेरुक शरीर से नमूना लेने के लिए सुझाव नहीं दिया जाता है, क्योंकि कॉर्टिकल हड्डी की परत आम तौर पर बहुत पतली होती है और इस प्रक्रिया से पूरी तरह से समाप्त होने की संभावना होती है (अनुभाग 2 में नोट देखें)।वजन कागज की एक छोटी शीट को एक मानक वजन ट्रे में रखें। कशेरुका प्रक्रिया को बाहर की ओर, बेहतर पहलू के साथ एक हाथ क्लैंप /विस में सुरक्षित करें। कशेरुकाओं को नीचे रखते हुए, एक वजन वाली ट्रे के ऊपर, एक छोटे गेज बिट (सामग्री की तालिका देखें) के साथ एक दंत ड्रिल का उपयोग करके लैमेला के साथ स्पिनस प्रक्रिया के संलयन द्वारा गठित वी आकार की नॉच के केंद्र में ऊपर की ओर ड्रिल करें (चित्र 3 देखें) जो कम गति और उच्च टोक़ पर सेट है। प्रतिरोध में ध्यान देने योग्य गिरावट होने पर ड्रिलिंग बंद करें। ड्रिलिंग स्थिति को थोड़ा बदलें और 50-100 मिलीग्राम हड्डी पाउडर एकत्र होने तक दोहराएं, जैसा कि 0.01 मिलीग्राम तक सटीक संलग्न संतुलन का उपयोग करके मापा जाता है ( सामग्री की तालिका देखें)। निष्कर्षण के लिए वजन कागज से हड्डी पाउडर को 2 एमएल कम-बाइंड ट्यूब में स्थानांतरित करें। -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें, अनिश्चित काल के लिए। शेष हड्डी / अतिरिक्त पाउडर को सूखे, तापमान नियंत्रित (25 डिग्री सेल्सियस) बाँझ वातावरण में वापसी / प्रत्यावर्तन तक स्टोर करें। सभी कचरे को ऑटोक्लेवेबल बायोहाजार्ड बैग या रिसेप्टेकल्स में निपटाएं। प्रत्येक नमूने के बीच ब्लीच/डीएनए परिशोधन समाधान/इथेनॉल और यूवी (तरंगदैर्ध्य: 254 एनएम) एक्सपोजर का उपयोग करके सभी पुन: प्रयोज्य उपकरणों (जैसे, क्लैंप, ड्रिल बिट्स, ड्रिल, आरी, आदि) को निष्फल / चित्र 3: कशेरुका शरीर और वक्ष कशेरुका के बेहतर कशेरुका आर्क कॉर्टिकल हड्डी शारीरिक नमूना स्थान। कृपया इस आकृति के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें। डिस्टल फालेंक्स का नमूनानोट: यह चरण वैकल्पिक है। शाफ्ट और/या एपिकल टफ्ट की कॉर्टिकल हड्डी की सबसे बाहरी परत को सतहके साथ स्क्रैप करके एक छोटे गेज ड्रिलिंग बिट से लैस डेंटल ड्रिल का उपयोग करके हटा दें और छोड़ दें। यह अत्यधिक पतली कॉर्टिकल हड्डी या किशोर अवशेषों वाले नमूनों के लिए संभव नहीं हो सकता है (अनुभाग 2 में नोट देखें)।एयरफ्लो बंद होने के साथ यूवी लाइट से लैस पीसीआर हुड या बायोसेफ्टी कैबिनेट (यूवी तरंग दैर्ध्य: 254 एनएम) के तहत एक समर्पित साफ कमरे में सभी नमूने लें। किसी भी आवारा हड्डी पाउडर / टुकड़ों को पकड़ने के लिए बेंचटॉप पर बाँझ एल्यूमीनियम पन्नी फैलाएं। सुनिश्चित करें कि पन्नी के निपटान से पहले सभी हड्डी के टुकड़े और जितना संभव हो उतना पाउडर बरामद किया गया है (प्रत्यावर्तन के लिए)। प्रत्येक नमूने के बीच पन्नी बदलें। इस्तेमाल की गई पन्नी को एक आटोक्लेवेबल बायोहाजार्ड बैग/रिसेप्टेकल में रखें। वजन कागज की एक छोटी शीट को एक मानक वजन ट्रे में रखें। नमूने को हैंडहेल्ड क्लैंप /विस में सुरक्षित करें, ऊपर की ओर बेहतर पक्ष। वजन ट्रे के ऊपर नमूने को पकड़ें, एक छोटे गेज ड्रिलिंग बिट से सुसज्जित दंत ड्रिल का उपयोग करके सबसे बाहरी घनी परतों के माध्यम से ड्रिलिंग करके एपिकल टफ्ट और शाफ्ट के अवर पक्ष से कॉर्टिकल हड्डी से हड्डी पाउडर एकत्र करें (चित्र 4 देखें)। प्रतिरोध में उल्लेखनीय कमी होने पर ड्रिलिंग बंद कर दें, क्योंकि यह हल्का, कैंसेलस सामग्री को दर्शाता है। इस प्रक्रिया को दोहराएं, प्रारंभिक ड्रिलिंग से बाहर की ओर विकिरण करें जब तक कि कम से कम 50-100 मिलीग्राम हड्डी पाउडर एकत्र नहीं हो जाता है, जैसा कि 0.01 मिलीग्राम तक सटीक संलग्न संतुलन का उपयोग करके मापा जाता है ( सामग्री की तालिका देखें)। निष्कर्षण के लिए वजन कागज से हड्डी पाउडर को 2 एमएल कम-बिंद, सुरक्षित-लॉक ट्यूब में स्थानांतरित करें। -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें, अनिश्चित काल के लिए। शेष हड्डी / अतिरिक्त पाउडर को एक सूखे, तापमान नियंत्रित (25 डिग्री सेल्सियस) बाँझ वातावरण में वापसी / प्रत्यावर्तन तक स्टोर करें। सभी कचरे को ऑटोक्लेवेबल बायोहाजार्ड बैग या रिसेप्टेकल्स में निपटाएं। प्रत्येक नमूने के बीच ब्लीच/डीएनए परिशोधन समाधान/इथेनॉल और यूवी एक्सपोजर का उपयोग करके सभी पुन: प्रयोज्य उपकरणों (जैसे, क्लैंप, ड्रिल बिट्स, ड्रिल, आरी, आदि) को निष्फल /नोट: छोटे नमूनों (जैसे, किशोर नमूने) के लिए नमूने के लिए उपलब्ध 50-100 मिलीग्राम कॉर्टिकल हड्डी से काफी कम हो सकता है। हालांकि, कम मात्रा में भी, इस शारीरिक नमूना स्थान को डीएनए11 में विशेष रूप से समृद्ध दिखाया गया है। चित्र 4: डिस्टल फालैंक्स शाफ्ट के साथ घनी कॉर्टिकल हड्डी के स्थानों और एपिकल टफ्ट के अवर पक्ष को दर्शाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। तालुस का नमूनाएयरफ्लो बंद होने के साथ यूवी लाइट से लैस पीसीआर हुड या बायोसेफ्टी कैबिनेट (तरंग दैर्ध्य: 254 एनएम) के तहत एक समर्पित साफ कमरे में सभी नमूने करें। किसी भी आवारा हड्डी पाउडर / टुकड़ों को पकड़ने के लिए बेंचटॉप पर बाँझ एल्यूमीनियम पन्नी फैलाएं। सुनिश्चित करें कि पन्नी के निपटान से पहले सभी हड्डी के टुकड़े और जितना संभव हो उतना पाउडर बरामद किया गया है (प्रत्यावर्तन के लिए)। प्रत्येक नमूने के बीच पन्नी बदलें। इस्तेमाल की गई पन्नी को एक आटोक्लेवेबल बायोहाजार्ड बैग/रिसेप्टेकल में रखें। वजन कागज की एक छोटी शीट को एक मानक वजन ट्रे में रखें। नमूने को हैंडहेल्ड क्लैंप/विस, गुंबद में ऊपर की ओर सुरक्षित करें। वजन ट्रे के ऊपर, टैलस, गुंबद को ऊपर की ओर और कलेक्टर की ओर मध्यवर्ती सतह को पकड़ें। कम गति और उच्च टोक़ पर सेट किए गए कम गेज बिट (सामग्री की तालिका देखें) के साथ दंत ड्रिल का उपयोग करके टैलस की गर्दन से ~ 1 मिमी की गहराई तक कॉर्टिकल हड्डी को स्क्रैप करें (चित्रा 5 देखें)। ड्रिलिंग स्थिति को थोड़ा बदलें और लगभग 50-100 मिलीग्राम हड्डी पाउडर एकत्र होने तक दोहराएं, जैसा कि 0.01 मिलीग्राम तक सटीक संलग्न संतुलन का उपयोग करके मापा जाता है ( सामग्री की तालिका देखें)। निष्कर्षण के लिए वजन कागज से हड्डी पाउडर को 2 एमएल कम-बाइंड ट्यूब में स्थानांतरित करें। -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें, अनिश्चित काल के लिए। शेष हड्डी / अतिरिक्त पाउडर को सूखे, तापमान नियंत्रित (25 डिग्री सेल्सियस) बाँझ वातावरण में स्टोर करें जब तक कि वापसी / प्रत्यावर्तन पूरा नहीं हो जाता। सभी कचरे को ऑटोक्लेवेबल बायोहाजार्ड बैग या रिसेप्टेकल्स में निपटाएं। प्रत्येक नमूने के बीच ब्लीच/डीएनए परिशोधन समाधान/इथेनॉल और यूवी (तरंगदैर्ध्य: 254 एनएम) एक्सपोजर का उपयोग करके सभी पुन: प्रयोज्य उपकरणों (जैसे, क्लैंप, ड्रिल बिट्स, ड्रिल, आरी, आदि) को निष्फल / चित्रा 5: कॉर्टिकल हड्डी की वसूली के लिए तालस का नमूना क्षेत्र। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। नोट: तालस में बहुत कम कॉर्टिकल हड्डी (एक पतली बाहरी परत) होती है। सामग्री को न केवल सतह से एकत्र किया जाना चाहिए, बल्कि कैनसेलस हड्डी की अंतर्निहित घनी परत भी होनी चाहिए।