Qui, abbiamo usato la colorazione rosso alizarina per dimostrare che l'esposizione all'acetato di piombo provoca un cambiamento di massa ossea nelle larve di zebrafish. Questo metodo di colorazione può essere adattato allo studio della perdita ossea nella perdita di larve di zebrafish indotta da altre sostanze tossiche pericolose.
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Articolo metodologico
Utilizzo della colorazione rosso alizarina per rilevare la perdita ossea indotta chimicamente nelle larve di zebrafish
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
La perdita ossea indotta chimicamente dovuta all'esposizione al piombo (Pb) potrebbe innescare una serie di impatti avversi sui sistemi scheletrici sia umani che animali. Tuttavia, gli effetti e i meccanismi specifici del pesce zebra rimangono poco chiari. Il rosso alizarina ha un'alta affinità per gli ioni calcio e può aiutare a visualizzare l'osso e illustrare la massa minerale scheletrica. In questo studio, abbiamo mirato a rilevare la perdita ossea indotta dall'acetato di piombo (PbAc) nelle larve di zebrafish utilizzando la colorazione rosso alizarina. Gli embrioni di zebrafish sono stati trattati con una serie di concentrazioni di PbAc (0, 5, 10, 20 mg/L) tra 2 e 120 ore dopo la fecondazione. La colorazione scheletrica a montaggio intero è stata condotta sulle larve a 9 giorni dopo la fecondazione e l'area totale colorata è stata quantificata utilizzando il software ImageJ. I risultati hanno indicato che i tessuti mineralizzati erano colorati in rosso e l'area colorata diminuiva significativamente nel gruppo di esposizione al PbAc, con un cambiamento dose-dipendente nella mineralizzazione ossea. Questo documento presenta un protocollo di colorazione per studiare i cambiamenti scheletrici nei difetti ossei indotti da PbAc. Il metodo può essere utilizzato anche nelle larve di zebrafish per la rilevazione della perdita ossea indotta da altre sostanze chimiche.
Introduzione
Studi recenti hanno confermato che l'osteoporosi dovuta a glucocorticoidi, inibitori dell'aromatasi e consumo eccessivo di alcol è comune 1,2. Il piombo (Pb) è un metallo tossico presente nelle piante, nel suolo e negli ambienti acquatici3. Sebbene gli effetti avversi del Pb sul corpo umano abbiano attirato molta attenzione, il suo impatto irreversibile sull'osso deve essere studiato ulteriormente. L'intossicazione da piombo provoca una vasta gamma di cambiamenti patologici sia nello scheletro in via di sviluppo che in quello adulto, influenzando le normali attività della vita. Gli stud....
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Protocollo
Tutte le procedure per animali descritte qui sono state esaminate e approvate dall'Animal Care Institute del Comitato Etico della Soochow University.
1. Allevamento ittico e raccolta di embrioni 14
- Dai da mangiare ai pesci tre volte al giorno; assicurarsi che i pesci zebra siano mantenuti a 28,5 ± 0,5 °C con un ciclo luce/buio di 14:10 h.
- Separare il pesce adulto maschio e femmina da tavole di isolamento in vasche di deposizione delle uova con un rapporto maschio-femmina di 2: 1 la sera.
- La mattina seguente, rimuovere le tavole di isolamento alle 9:00 e raccogliere gli e....
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Risultati
La colorazione rosso alizarina è un metodo sensibile e specifico per misurare i cambiamenti nella mineralizzazione ossea nelle larve di zebrafish. In questo studio, abbiamo osservato che PbAc ha avuto effetti avversi sulle larve di zebrafish, tra cui morte, malformazione, diminuzione della frequenza cardiaca e riduzione della lunghezza del corpo. Inoltre, le aree dello scheletro minerale delle larve di zebrafish sono state valutate per esaminare la perdita ossea indotta da PbAc. A 9 dpf (Figura 1A
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Discussione
Il pesce zebra è un modello adatto per studiare la malattia metabolica ossea. Rispetto ai modelli di roditori, i modelli di zebrafish sono relativamente veloci da stabilire e la misurazione della gravità della malattia è più facile. Nelle larve di zebrafish wild-type, la mineralizzazione dello scheletro della testa avviene a 5 dpf e lo scheletro assiale a 7 dpf15. Pertanto, le ossa craniche come PS, OP, CB e NC sono ben sviluppate a 9 dpf. Dopo che le larve sono state completamente decolorate e sb.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (81872646; 81811540034; 81573173) e dal Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions (PAPD).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 1 M Tris-HCl (pH = 7,5) | Solarbio, Pechino, Cina | 21 | per la detenzione del |
| 4% Paraformaldeide Fix Solution | BBI, Shanghai, Cina | 14 | tessuti di fissaggio |
| 10x tampone PBS | BBI, Shanghai, Cina | 15 | per il fissaggio |
| del 35% H2O2 | Yonghua, Jiangsu, Cina | 8 | rimozione del pigmento |
| 50 mL provetta da centrifuga | AKX, Jiangsu, Cina | 4 | |
| 95% etanolo anidro | Enox, Jiangsu, Cina | 2 | decolorazione |
| Alizarina rossa (purezza 99,5%) | Solarbio, Pechino, Cina | 1 | colorazione |
| Incubatore biochimico | Yiheng, Shanghai, Cina | 3 | allevamento di embrioni di zebrafish |
| Bilancia elettronica | Sartorius, Germania | 5 | pesatura delle materie prime solide |
| Glicerina (purezza 99,5%) | BBI,Shanghai,Cina | 7 | conservazione del pesce macchiato |
| ImageJ (software) | USA | 9 | analisi digitale |
| KOH (purezza 99,9%) | Sigma,America | 10 | soluzione sbiancante |
| Acetato di piombo triidrato (purezza 99,5%) | Aladino,Shanghai,Cina | 11 | |
| MgCl2 (Purezza 99,9%) | Aladdin,Shanghai,Cina | 12 | soluzione detergente |
| NIS-Elements F (software) | Nikon, Giappone | 13 | osservare e scattare foto |
| Pipe | AKX, Jiangsu, Cina | 18 | rimozione di embrioni e piastre di soluzione |
| (24 pozzetti) | Corning,America | 17 | contenitore per la colorazione di piastre di embrioni |
| (6 pozzetti) | Corning,America | 16 | contenitore per l'allevamento di embrioni |
| Tavolo vibrante | Beyotime, Cina | 19 | miscelazione della soluzione |
| Stereomicroscopio | Nikon, Giappone | 20 | osservazione e scatto di foto |
| Zebrafish | Zebrafish Experiment Center of Soochow University, Suzhou, Cina | 22 | animale da esperimento |
Riferimenti
- Compston, J., et al. Recommendations for the registration of agents for prevention and treatment of glucocorticoid-induced osteoporosis: an update from the Group for the Respect of Ethics and Excellence in Science. Osteoporosis International. 19 (9), 1247-1250 (2008).
- Rachner, T. D., Gobel, A., Jaschke, N. P., Hofbau....
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Ristampe e permessi
