यह प्रोटोकॉल ट्रिपैनोसोमाटिड संक्रमण के दौरान मेटाबोलाइट वितरण के 3 डी मॉडल को उत्पन्न करने के चरणों का वर्णन करता है, जिसमें नमूना संग्रह, मेटाबोलाइट निष्कर्षण, तरल क्रोमैटोग्राफी-टैंडेम मास स्पेक्ट्रोमेट्री डेटा अधिग्रहण, 3 डी मॉडल पीढ़ी का अवलोकन और अंत में, डेटा विज़ुअलाइज़ेशन शामिल है।
रोगज़नक़ ट्रोपिज़्म और रोग ट्रोपिज़्म ऊतक स्थानों को संदर्भित करता है जो रोगजनकों द्वारा चुनिंदा रूप से उपनिवेशित या क्षतिग्रस्त हो जाते हैं, जिससे स्थानीयकृत रोग के लक्षण होते हैं। मानव-संक्रामक ट्रिपैनोसोमामेटिड परजीवी में ट्रिपैनोसोमा क्रूज़ी शामिल हैं, जो चागस रोग के प्रेरक एजेंट हैं; ट्रिपैनोसोमा ब्रूसी, नींद की बीमारी का प्रेरक एजेंट; और लीशमैनिया प्रजातियां, लीशमैनियासिस के प्रेरक एजेंट। संयुक्त रूप से, वे दुनिया भर में 20 मिलियन लोगों को प्रभावित करते हैं। ये परजीवी विशिष्ट ट्रोपिज़्म दिखाते हैं: दिल, घुटकी, टी क्रूज़ी के लिए बृहदान्त्र, वसा ऊतक, अग्न्याशय, त्वचा, संचार प्रणाली और टी ब्रूसी के लिए केंद्रीय तंत्रिका तंत्र, डर्मोट्रोपिक लीशमैनिया उपभेदों के लिए त्वचा, और जिगर, प्लीहा, और विसेरोट्रोपिक लीशमैनिया उपभेदों के लिए अस्थि मज्जा। इसलिए ट्रिपैनोसोमाटिड रोग रोगजनन को समझने के लिए एक स्थानिक परिप्रेक्ष्य आवश्यक है। रासायनिक कार्टोग्राफी सूक्ष्मजीवविज्ञानी और प्रतिरक्षाविज्ञानी मापदंडों की तुलना में तरल क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री के माध्यम से उत्पन्न छोटे अणु बहुतायत के 3 डी विज़ुअलाइज़ेशन उत्पन्न करता है। यह प्रोटोकॉल दर्शाता है कि ट्रिपैनोसोमाटिड संक्रमण के दौरान रोगजनक प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए रासायनिक कार्टोग्राफी को कैसे लागू किया जा सकता है, जो व्यवस्थित ऊतक नमूनाकरण और मेटाबोलाइट निष्कर्षण से शुरू होता है, इसके बाद तरल क्रोमैटोग्राफी-अग्रानुक्रम मास स्पेक्ट्रोमेट्री डेटा अधिग्रहण होता है, और मेटाबोलाइट वितरण के 3 डी मानचित्रों की पीढ़ी के साथ समापन होता है। इस विधि का उपयोग कई शोध प्रश्नों के लिए किया जा सकता है, जैसे कि टी क्रूज़ी, टी ब्रूसी, या लीशमैनिया द्वारा ऊतक उपनिवेशीकरण के लिए पोषक तत्वों की आवश्यकताएं, संक्रमण की साइटों पर इम्यूनोमेटाबोलिज्म, और स्थानीय ऊतक चयापचय गड़बड़ी और नैदानिक रोग के लक्षणों के बीच संबंध, जिससे ट्रिपैनोसोमाटिड रोग रोगजनन में व्यापक अंतर्दृष्टि होती है।
ट्रिपैनोसोमाटिड परजीवी में लीशमैनिया प्रजातियां, अफ्रीकी ट्रिपैनोसोम (ट्रिपैनोसोमा ब्रूसी), और अमेरिकी ट्रिपैनोसोमस (ट्रिपैनोसोमा क्रूजी) शामिल हैं। लीशमैनिया प्रोटोजोआ लीशमैनियासिस का कारण बनता है, जिसमें आत्म-उपचार और आत्म-सीमित स्थानीयकृत स्थानीयकृत लीशमैनियासिस, म्यूकोक्यूटेनियस लीशमैनियासिस शामिल है जिसमें मुंह, नाक और गले के म्यूकोसल ऊतक क्षतिग्रस्त हो जाते हैं, और आंतों के अंगों के लिए परजीवी ट्रोपिज्म के साथ आंत ों की लीशमैनियासिस बुखार और हेपेटोस्प्लेनोमेगाली 1,2 का कारण बनती है। टी ब्रूसी मानव अफ्रीकी ट्रिपैनोसोमियासिस (एचएटी) का कारण बनता है, जिसे नींद की बीमारी के रूप में भी जाना जाता है, मुख्य रूप से अफ्रीकी देशों में रिपोर्ट किया गया है। नैदानिक संकेतों और लक्षणों में हेपेटोस्प्लेनोमेगाली, बुखार, सिरदर्द, मस्कुलोस्केलेटल दर्द, लिम्फैडेनोपैथी, और हीमो-लसीका चरण में एनीमिया शामिल हैं जब परजीवी रक्तप्रवाह और लसीका के लिए स्थानीयकृत होते हैं। इसके बाद मेनिंगो-एन्सेफेलिटिक चरण होता है, जहां परजीवी केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के लिए स्थानीयकृत होते हैं और नींद की गड़बड़ी, व्यवहार परिवर्तन और अंततः घातक कोमास 4 का कारण बनते हैं। T. cruzi Chagas रोग का कारण बनता है, अमेरिका में स्थानिक. संक्रमित व्यक्ति एक प्रारंभिक तीव्र चरण का अनुभव करते हैं, आमतौर पर स्पर्शोन्मुख, व्यापक परजीवी ट्रोपिज़्म के साथ। लगभग 10% -30% संक्रमित व्यक्तियों को संक्रमण के दशकों के बाद पुरानी अवस्था के लक्षणों का अनुभव होता है, जो मेगाओसोफेगस, मेगाकोलन और हृदय संबंधी जटिलताओं की विशेषता है5,6।
मेटाबोलोमिक्स छोटे आणविक प्रजातियों (50-1,500 डीए) का अध्ययन करता है, जिसमें प्राथमिक या माध्यमिक चयापचय से जैविक यौगिक और बाहरी रूप से व्युत्पन्न यौगिक जैसे दवाएं या खाद्य-व्युत्पन्न अणु शामिल हैं। मेजबान-रोगज़नक़ इंटरैक्शन के संदर्भ में, मेटाबोलोमिक्स मेजबान मेटाबोलाइट वातावरण पर संक्रमण के प्रभाव का पता लगा सकता है, जो मेजबान पर रोगज़नक़ के प्रभाव तक पहुंचने में महत्वपूर्ण है। यह मेजबान पोषण और प्रतिरक्षाविज्ञानी वातावरण के लिए रोगज़नक़ अनुकूलन का भी आकलन कर सकता है7,8,9। मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) और परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर) स्पेक्ट्रोस्कोपी सामान्य मेटाबोलोमिक्स उपकरण हैं जिनका उपयोग चयापचयों की पहचान, मात्रा निर्धारित और विशेषता के लिए किया जाता है। इस “ओमिक्स” दृष्टिकोण को बायोमार्कर खोज और दवा विकास 10,11 पर भी लागू किया जा सकता है।
ट्रिपैनोसोमाटिड परजीवी के विशिष्ट ऊतक ट्रोपिज्म को देखते हुए, स्थानिक मेटाबोलोमिक्स विश्लेषण उन बीमारियों के रोगजनन में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि को सक्षम कर सकते हैं जो वे पैदा करते हैं। मेटाबोलाइट्स के स्थानिक वितरण का मानचित्रण करने से पता चला कि माउस हृदय ऊतक में क्रोनिक ट्रिपैनोसोमा क्रूजी संक्रमण और माउस गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल ट्रैक्ट में तीव्र और दीर्घकालिक ट्रिपैनोसोमा क्रूजी संक्रमण से स्थानीय रूप से प्रभावित मेटाबोलाइट्स 6,12,13। विशेष रूप से, 3 डी रासायनिक कार्टोग्राफी ने क्रोनिक रूप से ट्रिपैनोसोमा क्रूज़ी-संक्रमित चूहों के दिल के ऊतकों में परजीवी दृढ़ता और चयापचय परिवर्तनों के बीच एक डिस्कनेक्ट का प्रदर्शन किया। चयापचय हृदय के निचले और एपिकल खंडों में सबसे अधिक परेशान था, जो चागस रोग के लक्षणों (कार्डियक एपिकल एन्यूरिज्म) की साइटों के साथ मेल खाता था। मेटाबोलाइट परिवारों को विशिष्ट कार्डियक साइटों पर संक्रमण से परेशान किया जाता है और रोग की गंभीरता से संबंधित है, जिसमें एसाइलकार्निटाइन और ग्लिसरोफॉस्फोकोलिन्स 12,13,14 शामिल हैं। जठरांत्र संबंधी मार्ग में, लगातार चयापचय परिवर्तन चागास रोग के लक्षणों की साइटों के साथ सहमत होते हैं: अन्नप्रणाली और बृहदान्त्र। इसके विपरीत, चयापचय को उन साइटों पर फिर से सामान्यीकृत किया जाता है जो चागस रोग के लक्षणों से जुड़े नहीं हैं, जैसे कि छोटी आंत। जठरांत्र संबंधी मार्ग में संक्रमण से स्थानीय रूप से परेशान मेटाबोलाइट्स में एसाइलकार्निटाइन, ग्लिसरोफॉस्फोकोलिन, किनुरेनिन, ट्रिप्टोफैन और चोलिक एसिड शामिल हैं। इसके अलावा, इन विश्लेषणों ने चागस रोग 6 के प्रति सहिष्णुता के एक नए चयापचय तंत्र की पहचान को सक्षम किया। त्वचीय लीशमैनियासिस के अध्ययन के लिए इन तरीकों को लागू करने से घाव की साइट पर महत्वपूर्ण चयापचय गड़बड़ी का पता चला, लेकिन घाव-आसन्न, मैक्रोस्कोपिक रूप से स्वस्थ ऊतक में विशिष्ट चयापचय परिवर्तन भी हुए। उदाहरण के लिए, घाव स्थल पर ग्लूटामाइन समाप्त हो गया था, जबकि m / z (द्रव्यमान से चार्ज अनुपात) 200-299, 400-499, 500-599, और 600-699 में ग्लिसरोफॉस्फोकोलाइन्स घाव स्थल पर काफी बढ़ गए थे। पीसी (ओ -34: 1) केवल घाव-आसन्न साइटों 15 पर बढ़ाया गया था।
इस पांडुलिपि का लक्ष्य मेटाबोलाइट वितरण (“रासायनिक कार्टोग्राफी”) के 3 डी मॉडल उत्पन्न करने के लिए आवश्यक चरणों को प्रदर्शित करना है, जैसा कि ट्रिपैनोसोमाटिड परजीवी संक्रमण मॉडल (चित्रा 1) पर लागू होता है। यह दृष्टिकोण मेटाबोलोमिक्स और मेटाबोलोमिक्स डेटा प्रोसेसिंग के संदर्भ में कई महत्वपूर्ण प्रगति पर बनाता है, विशेष रूप से 3 डी मॉडल पर मेटाबोलोमिक्स डेटा को आसानी से प्लॉट करने के लिए ‘आईएलआई सॉफ्टवेयर’ का विकास।
ट्रिपैनोसोमाटिड संक्रमणों को समझना उपन्यास दवा विकास और उपचार के दृष्टिकोण का मार्गदर्शन करने के लिए आवश्यक है। यह रासायनिक कार्टोग्राफी विधि विशिष्ट रूप से चयापचय और ट्रिपैनोसोमाटिड रोग रोगजनन के बीच संबंधों में कार्रवाई योग्य अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए तैयार है, इस प्रकार इस ट्रांसलेशनल आवश्यकता को संबोधित करती है।
पृष्ठभूमि संदूषण को कम करने के लिए मेटाबोलाइट निष्कर्षण और एमएस विश्लेषण के दौरान केवल एलसी-एमएस ग्रेड सॉल्वैंट्स की सिफारिश की जाती है। बहुलक संदूषण 35, आमतौर पर पैराफिन फिल्म और / या अन्य प्लास्टिक 36,37,38 से व्युत्पन्न, जहां संभव हो, से बचा जाना चाहिए। पैराफिल्म, विशेष रूप से, कभी भी उपयोग नहीं किया जाना चाहिए। ये पहलू महत्वपूर्ण हैं क्योंकि एलसी-एमएस डेटा की गुणवत्ता नमूना तैयारी और मेटाबोलाइट निष्कर्षण के दौरान उपयोग की जाने वाली सामग्रियों पर निर्भर करती है। ‘ili भूखंडों’ उत्पन्न करने से पहले डेटा की गुणवत्ता सुनिश्चित की जानी चाहिए। इसके अलावा, इन व्यापक स्थानिक मेटाबोलोमिक्स मानचित्रों को उत्पन्न करने के लिए इन मानचित्रों में अंतराल से बचने के लिए सभी एकत्र किए गए नमूनों से सभी आसन्न ऊतक नमूनों और मेटाबोलाइट निष्कर्षण के संग्रह की आवश्यकता होती है। संग्रह प्रक्रियाओं, मेटाबोलाइट निष्कर्षण और एलसी-एमएस विश्लेषण के रसद, और लागत इस प्रकार विचार किया जाना चाहिए और तदनुसार योजना बनाई जानी चाहिए।
इस प्रोटोकॉल को कई तरीकों से उपयोगकर्ता की आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए संशोधित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, मेटाबोलाइट निष्कर्षण के दौरान उपयोग किए जाने वाले सॉल्वैंट्स की ध्रुवीयता और घुलनशीलता प्रभावित करेगी कि मेटाबोलाइट्स का पता लगाया जाता है39। untargeted रासायनिक कार्टोग्राफी विश्लेषण के लिए पता लगाया मेटाबोलाइट सुविधाओं की विविधता को अधिकतम करने के लिए, कई निष्कर्षण चरणों और सॉल्वैंट्स के संयोजन की सिफारिश की है। उदाहरण के लिए, यह विधि निष्कर्षण सॉल्वैंट्स के रूप में डाइक्लोरोमेथेन, मेथनॉल और पानी का उपयोग करती है क्योंकि वे गैर-ध्रुवीय और ध्रुवीय अणुओं का सटीक पता लगाने में सक्षम बनाते हैं20,40। हालांकि, ये सॉल्वैंट्स प्रत्येक एमएस प्रयोग के लिए सार्वभौमिक रूप से उपयुक्त नहीं हैं, और शोधकर्ताओं को अपनी परियोजना के लक्ष्यों के आधार पर निष्कर्षण सॉल्वैंट्स का चयन करना चाहिए। इसी तरह, विभिन्न एलसी-एमएस / एमएस स्थितियों का उपयोग किया जा सकता है, जैसे कि सामान्य चरण क्रोमैटोग्राफी के साथ उलट-चरण क्रोमैटोग्राफी को बदलना। वैकल्पिक स्तंभों का उपयोग C8 क्रोमैटोग्राफी के बजाय रिवर्स-फेज डेटा संग्रह के लिए भी किया जा सकता है, हालांकि अनुभवजन्य रूप से, C8 क्रोमैटोग्राफी ऊतक लिपिड के लिए अधिक मजबूत है और इसमें कम क्लॉगिंग आवृत्ति होती है। वैचारिक रूप से, इन प्रोटोकॉल को अन्य मास स्पेक्ट्रोमेट्री विधियों जैसे गैस क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री, आदि पर भी लागू किया जा सकता है।
एक वैकल्पिक दृष्टिकोण मास स्पेक्ट्रोमेट्री इमेजिंग है। दरअसल, मास स्पेक्ट्रोमेट्री इमेजिंग दृष्टिकोण के विपरीत, तरल क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री स्वाभाविक रूप से स्थानिक जानकारी को संरक्षित नहीं करता है10। रासायनिक कार्टोग्राफी दृष्टिकोण परियोजना अवधारणा के समय, नमूना मेटाडेटा में, और डेटा प्रसंस्करण चरणों में नमूना स्थान को शामिल करके इस अंतर को पाटते हैं। मास स्पेक्ट्रोमेट्री इमेजिंग के विपरीत, इस रासायनिक कार्टोग्राफी दृष्टिकोण की एक ताकत, आत्मविश्वास एनोटेशन (मेटाबोलोमिक्स स्टैंडर्ड्स इनिशिएटिव लेवल 1 या स्तर 2 एनोटेशन कॉन्फिडेंस 41) प्रदान करने की क्षमता है, मास स्पेक्ट्रोमेट्री इमेजिंग के विपरीत जहां अधिकांश एप्लिकेशन केवल एनोटेशन के लिए सटीक द्रव्यमान पर भरोसा करते हैं। मास स्पेक्ट्रोमेट्री इमेजिंग ठीक-ठाक स्थानिक मानचित्रण को सक्षम करेगी, कभी-कभी एकल-सेल स्तर तक नीचे, उदाहरण के लिए, 42,43। इसके विपरीत, रासायनिक कार्टोग्राफी दृष्टिकोण मेटाबोलाइट वितरण के बड़े पैमाने पर क्रॉस-ऑर्गन मैपिंग को अत्यधिक विशिष्ट पूरे-पशु क्रायोसेक्शनिंग कौशल की आवश्यकता के बिना सक्षम करते हैं। रासायनिक कार्टोग्राफी विकसित किए जा रहे कई स्थानिक ट्रांसक्रिप्टोमिक दृष्टिकोणों के पूरक सबूत प्रदान करती है, उदाहरण के लिए, 44, ‘फेनोटाइप के निकटतम ओमिक्स परत’ 45 पर ध्यान केंद्रित करने के लाभ के साथ। परजीवी भार परिमाणीकरण के लिए वैकल्पिक तरीकों में नमूना संग्रह 6 के समय बायोल्यूमिनेसेंस को मापना शामिल है। स्थानीयकृत परजीवी बोझ और ऊतक क्षति का आकलन करने के लिए कॉन्फोकल या इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी को सक्षम करने के लिए ठीक खंडों को भी एकत्र किया जा सकता है। पानी homogenate, जो इस प्रोटोकॉल और पूर्व प्रकाशन13 में साइटोकाइन परिमाणीकरण के लिए उपयोग किया जाता है, का उपयोग ऊतक क्षति के प्रोटीन-आधारित मार्करों को मापने के लिए भी किया जा सकता है।
परिणामी एलसी-एमएस डेटा को प्लॉट करने के लिए उपयुक्त 3 डी मॉडल प्राप्त करने के कई तरीके भी हैं। यहां सुझाई गई विधि के अलावा, मॉडल को विभिन्न ऑनलाइन विक्रेताओं से पूर्व-निर्मित खरीदा जा सकता है। सुनिश्चित करें कि उपयोग की शर्तें इच्छित उपयोग के साथ मेल खाती हैं, विशेष रूप से प्रकाशन से संबंधित। स्कैनर निर्देशों के अनुसार 3 डी स्कैनर का उपयोग करके बड़े अंगों के लिए मॉडल डे नोवो उत्पन्न किए जा सकते हैं। MATLAB जैसे विकल्प रासायनिक कार्टोग्राफी 46 के लिए 3 डी मॉडल उत्पन्न करने और विज़ुअलाइज़ करने के लिए मौजूद हैं, लेकिन उन्हें मुख्य रूप से ‘ili16‘ के विकास से पहले लागू किया गया था। MATLAB एक डेटा विश्लेषण और प्रोग्रामिंग टूल सूट है जो कई क्षेत्रों में विभिन्न प्रकार के अनुप्रयोगों की पेशकश करता है। हालांकि, MATLAB न तो मुफ़्त है और न ही ओपन-सोर्स है, और इसके लिए MATLAB इंटरफेस के साथ परिचित होने की आवश्यकता होती है, विशेष रूप से MATLAB पर विचार करना मास स्पेक्ट्रोमेट्री डेटा को संसाधित करने के लिए विकसित नहीं किया गया था। इस प्रस्तावित विधि के विकल्प, अर्थात्, स्केचअप, मेस्लैब, और ‘इली, स्वतंत्र रूप से सुलभ, उपयोगकर्ता के अनुकूल हैं, और रासायनिक कार्टोग्राफी उद्देश्यों के लिए MATLAB के समान कार्य प्रदान करते हैं।
यह विधि नमूना तैयारी और मेटाबोलाइट निष्कर्षण के बारे में मजबूत है। समस्या निवारण सबसे अधिक बार LC-MS डेटा अधिग्रहण चरण पर आवश्यक है। यह इस लेख के दायरे से परे है। पाठकों को एलसी-एमएस डेटा अधिग्रहण समस्या निवारण पर उत्कृष्ट प्रकाशनों के लिए निर्देशित किया जाता है, जिसमें 20,47 शामिल हैं। इसी तरह, मेटाबोलाइट एनोटेशन की जटिलताएं 3 डी मॉडल पीढ़ी पर इस विधि के ध्यान के दायरे से परे हैं। इस विषय पर उपयोगी संदर्भों में 24,25,48,49 शामिल हैं।
जबकि यह विधि प्रभावी रूप से रोग रोगजनन की पड़ताल करती है, इस दृष्टिकोण की सीमाएं हैं, जिनमें से कुछ किसी भी मेटाबोलोमिक्स प्रयोग में आम हैं। ऐसी ही एक सीमा एलसी-एमएस फीचर्स 50 की कम एनोटेशन दर है, जो संदर्भ वर्णक्रमीय पुस्तकालयों की उपलब्धता और गुणवत्ता पर निर्भर है। एक और सीमा यह है कि यह प्रोटोकॉल आरएनए संरक्षण अभिकर्मकों की असंगतता के कारण एमआरएनए को संरक्षित नहीं करता है जैसे कि एलसी-एमएस / एमएस विश्लेषण के साथ आरएनएलेटर। हालांकि, प्रोटीन की गुणवत्ता डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए पर्याप्त है और इस प्रकार एमआरएनए-आधारित विश्लेषणों को प्रतिस्थापित कर सकती है।
संक्रमण रोगजनन के लिए एक रासायनिक कार्टोग्राफी दृष्टिकोण सीधे दर्शाता है कि जीवाणु, वायरल, या परजीवी संक्रमण अंग प्रणालियों में कैसे विकसित होते हैं और स्थानीयकृत बीमारी का कारण बनते हैं। इन क्षेत्रीय subsamples का विश्लेषण और 3 डी मॉडल उत्पन्न अंततः कैसे मेटाबोलाइट्स तीन आयामी अंतरिक्ष भर में कार्य करता है, आणविक जीव विज्ञान के इन पहले अपरिचित स्थानिक आयामों पर प्रकाश डाला. इस प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, उदाहरण के लिए, मेटाबोलाइट स्थानीयकरण की तुलना ट्रिपैनोसोमा क्रूज़ी परजीवी लोड से की गई थी। परिणामों ने रोगज़नक़ और मेजबान ऊतक के बीच संबंध को स्पष्ट किया और चागस रोग लक्षण प्रगति 6 की चयापचय गतिशीलता का भी प्रदर्शन किया। रासायनिक कार्टोग्राफी विधियों को विभिन्न विषयों पर भी लागू किया गया है, जैसे कि मानव निर्मित पर्यावरण इंटरैक्शन 51,52,53, मानव त्वचा 46 और फेफड़ों जैसे अंग प्रणालियों का रासायनिक मेकअप 54, और पौधे चयापचय और पर्यावरण इंटरैक्शन 55। भविष्य के अनुप्रयोगों में स्थानीयकृत रोग सहिष्णुता और लचीलापन का आकलन करना शामिल हो सकता है, या स्थानीय मेटाबोलाइट स्तरों, रोगज़नक़ ट्रोपिज़्म और ट्रिपैनोसोमाटिड संक्रमण से परे मॉडल में रोग ट्रोपिज़्म के बीच संबंध। इस दृष्टिकोण में वर्तमान फार्माकोकाइनेटिक्स प्रोटोकॉल का विस्तार करने के लिए व्यापक प्रयोज्यता भी होनी चाहिए, ताकि स्थानीय ऊतक दवा के स्तर और दवा चयापचय बनाम समग्र चयापचय संदर्भ, ऊतक क्षति और रोगज़नक़ निकासी के बीच संबंधों का आकलन किया जा सके। कुल मिलाकर, रासायनिक कार्टोग्राफी विभिन्न नमूना प्रकारों में मेटाबोलाइट वितरण के अद्वितीय अन्वेषणों की अनुमति देता है, जिसमें रोग रोगजनन, मानव स्वास्थ्य, मानव-पर्यावरण इंटरैक्शन और माइक्रोबियल गतिशीलता सहित अनुप्रयोग शामिल हैं।
The authors have nothing to disclose.
लौरा-इसोबेल McCall, पीएचडी, Burroughs Wellcome फंड से संक्रामक रोग पुरस्कार के रोगजनन में एक जांचकर्ता रखती है। लेखक आगे एनआईएच पुरस्कार संख्या R21AI148886 से समर्थन को स्वीकार करना चाहते हैं, ओक्लाहोमा सेंटर फॉर रेस्पिरेटरी एंड इंफेक्शियस डिजीज (ओसीआरआईडी) से एनआईएच पुरस्कार संख्या P20GM103648 के तहत एक पायलट अनुदान, और ओक्लाहोमा विश्वविद्यालय (LIM के लिए) से स्टार्ट-अप फंड। सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी नहीं कि फंडर्स के आधिकारिक विचारों का प्रतिनिधित्व करे। लेखक भी इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले उपकरणों के डेवलपर्स को धन्यवाद देना चाहते हैं। सभी प्रासंगिक प्रकाशनों को उद्धृत किया गया है, जहां लागू हो।
1.5 mL Eppendorf tubes | NA | NA | any brand, as available |
1 L bottle, pyrex | NA | NA | any brand, as available |
1 L graduated cylinder, pyrex | NA | NA | any brand, as available |
2 mL SafeLock Eppendorf tubes | VWR | 20901-540 | use the appropriate tube model for the available tissue homogenizer |
3D model (de-novo generated according to protocol steps, or purchased) | NA | NA | as appropriate for system under investigation |
5 mm stainless steel bead | Qiagen | 69989 | |
96 well plate | Fisher | 3252449 | |
AATTCCTCCAAGCAGCGGATA primer | NA | NA | any brand, as available; published in Piron, M. et al. Development of a real-time PCR assay for Trypanosoma cruzi detection in blood samples. Acta tropica. 103 (3), 195–200 (2007). |
analytical balance | NA | NA | any brand, as available |
ASTCGGCTGATCGTTTTCGA primer | NA | NA | any brand, as available; published in Piron, M. et al. Development of a real-time PCR assay for Trypanosoma cruzi detection in blood samples. Acta tropica. 103 (3), 195–200 (2007). |
benchtop centrifuge with microcentrifuge, falcon tube and 96-well-plate capacity | NA | NA | any brand, as available |
biosafety cabinet | NA | NA | class II, type A2; any brand, as available |
CAGCAAGCATCTATGCACTTAG ACCCC primer |
NA | NA | any brand, as available; published in Cummings, K.L., Tarleton, R.L. Rapid quantitation of Trypanosoma cruzi in host tissue by real-time PCR. Molecular and biochemical parasitology. 129 (1), 53–59 (2003). |
camera | NA | NA | any brand, as available. A cellphone camera is adequate for this protocol |
chemiluminescent-capable imaging system | NA | NA | any system, as available |
cotton balls | NA | NA | any brand, as available |
cryogloves | VWR | 97008-208 | replace with any brand, as available |
dissection scissors | NA | NA | any brand, as available |
dry ice | NA | NA | any brand, as available |
extra-length forceps | NA | NA | any brand, as available |
flammable-grade refrigerator | NA | NA | any brand, as available |
freezer storage boxes for microcentrifuge tubes | NA | NA | any brand, as available |
fume hood | NA | NA | any brand, as available |
high-resolution mass spectrometer | NA | NA | any brand, as available, such as ThermoFisher Q-Exactive Plus (catalog number 0726030) |
ice bucket | NA | NA | any brand, as available |
ili software | ili.embl.de | NA | |
isoflurane | Covetrus | 29405 | |
large tupperware | NA | NA | any brand, as available; large enough to comfortably contain mouse, cotton ball |
LC-MS grade acetonitrile | Fisher Optima | A955-4 | |
LC-MS grade dicholoromethane | Fisher Optima | D151-4 | |
LC-MS grade formic acid | Fisher Optima | A11750 | |
LC-MS grade methanol | Fisher Optima | A456-4 | |
LC-MS grade water | Fisher Optima | W64 | |
liquid chromatography column | Phenomenex | 00B-4499-AN | may be changed to other brands and models as appropriate for the metabolites of interest |
liquid chromatography column guard cartridge | Phenomenex | AJ0-8784 | may be changed to other brands and models as appropriate for the metabolites of interest |
liquid chromatography column guard cartridge holder | Phenomenex | AJ0-9000 | may be changed to other brands and models as appropriate for the metabolites of interest |
liquid nitrogen | NA | NA | any brand, as available |
luciferin | Goldbio | LUCK-1G | |
MeshLab software | https://www.meshlab.net/ | NA | |
Meshmixer software | https://www.meshmixer.com/ | NA | |
MS calibrant | NA | NA | appropriate one for available instrument |
MS data processing software | NA | NA | multiple options available; authors recommend MZmine |
MSConvert software | http://proteowizard.sourceforge.net/ | NA | |
Nanodrop | ThermoFisher | ND-ONE-W | other nanodrop models are also suitable |
p1000 pipet tips | NA | NA | use the appropriate brand to fit available pipettors |
p1000 pipettor | NA | NA | any brand, as available |
p20 pipette tips | NA | NA | use the appropriate brand to fit available pipettors |
p20 pipettor | NA | NA | any brand, as available |
p200 pipette tips | NA | NA | use the appropriate brand to fit available pipettors |
p200 pipettor | NA | NA | any brand, as available |
personal protective equipment (gloves, lab coat, safety glasses/goggles; faceshield) | NA | NA | any brand, as available |
Q-Plex Mouse Cytokine – Screen (16-Plex) | Quansys biosciences | 110949MS | can replace with other protein-based cytokine assays such as other commercial cytokine ELISA kits |
Quick-DNA Miniprep Plus Kit (200 preps) | Zymo | D4069 | replace with any brand of mammalian DNA extraction kit, as available |
real-time thermocycler | NA | NA | any brand, as available |
salt shaker or tea infuser | NA | NA | any brand; to contain isoflurane-soaked cotton ball and prevent contact with mouse skin |
SketchUp software | https://www.sketchup.com/ | NA | |
specimen forceps | NA | NA | any brand, as available |
speedvac with microcentrifuge tube and 96-well-plate capacity | NA | NA | any brand, as available |
spreadsheet software | https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel | NA | can replace with other spreadsheet management software, as applicable |
sulfachloropyridazine | Sigma | S9882-100G | |
sulfadimethoxine | Sigma | S7007-10G | |
Sybr green qPCR reaction mix | Fisher | A25780 | can replace with other Sybr green qPCR reaction mixes, as desired |
TCCCTCTCATCAGTTCTAT GGCCCA primer |
NA | NA | any brand, as available; published in Cummings, K.L., Tarleton, R.L. Rapid quantitation of Trypanosoma cruzi in host tissue by real-time PCR. Molecular and biochemical parasitology. 129 (1), 53–59 (2003). |
tissue homogenizer | NA | NA | any brand, as available; for example, Qiagen TissueLyser II, catalog number 85300, with TissueLyser Adapter Set (2 x 24), catalog number 69982 |
tissue samples | NA | NA | from appropriate infection model |
TissueLyser single-bead dispenser | Qiagen | 69965 | |
UHPLC | NA | NA | any brand, as available, such as ThermoFisher Vanquish (catalog number IQLAAAGABHFAPUMBHV) |
ultra-low temperature freezer (-80) | NA | NA | any brand, as available |
ultrasonic bath | NA | NA | any system, as available |
wet ice | NA | NA | any brand, as available |
zone-free sealing film | VWR | 490007-390 |