Detta protokoll beskriver stegen för att generera en 3D-modell av metabolitfördelning under trypanosomatidinfektion, inklusive provsamling, metabolitutvinning, en översikt över vätskekromatografi-tandem masspektrometridataförvärv, 3D-modellgenerering och slutligen datavisualisering.
Patogen tropism och sjukdom tropism hänvisar till vävnad platser selektivt koloniserade eller skadade av patogener, vilket leder till lokaliserade sjukdom symtom. Human-infective trypanosomatid parasiter inkluderar Trypanosoma cruzi, orsaksmedlet för Chagas sjukdom; Trypanosoma brucei, orsaksmedlet för sömnsjuka; och Leishmania arter, orsaksmedel av leishmaniasis. Tillsammans påverkar de 20 miljoner människor över hela världen. Dessa parasiter visar specifika trohet: hjärta, matstrupe, kolon för T. cruzi, fettvävnad, bukspottkörtel, hud, cirkulationssystem och centrala nervsystemet för T. brucei, hud för dermotropa Leishmania stammar och lever, mjälte och benmärg för viscerotropic Leishmania stammar. Ett rumsligt perspektiv är därför viktigt för att förstå trypanosomatid sjukdom patogenes. Kemisk kartografi genererar 3D-visualiseringar av små molekylöverflödet som genereras via flytande kromatografi-masspektrometri, i jämförelse med mikrobiologiska och immunologiska parametrar. Detta protokoll visar hur kemisk kartografi kan tillämpas för att studera patogena processer under trypanosomatid infektion, med början från systematisk vävnad provtagning och metabolit extraktion, följt av flytande kromatografi-tandem masspektrometri data förvärv, och avslutas med generering av 3D kartor av metabolit distribution. Denna metod kan användas för flera forskning frågor, såsom näringsbehov för vävnad kolonisering av T. cruzi, T. brucei eller Leishmania, immunometabolism på infektionsställen, och förhållandet mellan lokala vävnad metabolisk störning och kliniska sjukdom symtom, vilket leder till omfattande inblick i trypanosomatid sjukdom patogenes.
Trypanosomatid parasiter består av Leishmania arter, afrikanska trypanosomer (Trypanosoma brucei) och amerikanska trypanosomer (Trypanosoma cruzi). Leishmania protozoa orsakar leishmaniasis, som inkluderar självläkande och självbegränsad lokaliserad testning leishmaniasis, mucocutaneous leishmaniasis där slemhinnan vävnader i mun, näsa och hals skadas, och visceral leishmaniasis med parasit tropism till viscerala organ orsakar feber och hepatosplenomegaly1,2. T. brucei orsakar human afrikansk trypanosomiasis (HAT), även känd som sömnsjuka, främst rapporterad i afrikanska länder3. De kliniska tecknen och symptomen inkluderar hepatosplenomegaly, feber, huvudvärk, muskuloskeletala smärtor, lymfadenopatier och anemi i hemo-lymfatiska scenen när parasiter lokaliseras till blodomloppet och lymfatiska. Detta följs av meningo-encephalitic scenen, där parasiter lokaliserar till centrala nervsystemet och orsakar sömnstörningar, beteendeförändring och så småningom dödlig koma4. T. cruzi orsakar Chagas sjukdom, endemisk i Amerika. Infekterade individer upplever ett första akut stadium, vanligtvis asymtomatiskt, med bred parasittropism. Cirka 10%-30% av infekterade individer upplever kroniska stadiumsymtom efter årtionden av infektion, kännetecknad av megaoesofager, megakolon och kardiovaskulära komplikationer5,6.
Metabolomik studerar små molekylära arter (50-1 500 Da), inklusive biologiska föreningar från primär eller sekundär metabolism och externt härledda föreningar som läkemedel eller livsmedelsbaserade molekyler. I samband med interaktioner mellan värdpatogener kan metabolomik utforska infektionens inverkan på värdmetabolitmiljöer, avgörande för att få tillgång till patogenens effekt på värden. Den kan också bedöma patogenanpassningar till värdens näringsmässiga och immunologiska miljö7,8,9. Masspektrometri (MS) och kärnmagnetisk resonans (NMR) spektroskopi är vanliga metabolomikverktyg som används för att identifiera, kvantifiera och karakterisera metaboliter. Denna “omics” -metod kan också tillämpas på biomarkörupptäckt och läkemedelsutveckling10,11.
Med tanke på den specifika vävnad tropism av trypanosomatid parasiter, rumsliga metabolomics analyser kan möjliggöra betydande inblick i patogenesen av de sjukdomar de orsakar. Kartläggning av den rumsliga fördelningen av metaboliter visade metaboliter lokalt drabbade av kronisk Trypanosoma cruzi infektion i mus hjärtat vävnad och akut och långsiktiga Trypanosoma cruzi infektion i musen mag-tarmkanalen6,12,13. Specifikt visade 3D kemisk kartografi en koppling mellan parasit persistens och metaboliska förändringar i hjärtat vävnaden av kroniskt Trypanosoma cruzi-infekterade möss. Metabolism var mest störd i lägre och apikala segment av hjärtat, matchande med platser av Chagas sjukdom symtom (hjärt apikal stora). Metabolitfamiljer som störs av infektion på specifika hjärtplatser och korrelerade till sjukdomens svårighetsgrad inkluderar akrylkarnitiner och glycerofofoboliner12,13,14. I mag-tarmkanalen överensstämde ihållande metaboliska förändringar med platser med Chagas sjukdomssymtom: matstrupe och kolon. Däremot normaliseras ämnesomsättningen på platser som inte är associerade med Chagas sjukdomssymtom, såsom tunntarmen. Metaboliter som lokalt störs av infektion i mag-tarmkanalen inkluderar akrylkarnitiner, glycerofofoboliner, kynurenin, tryptofan och kolsyra. Dessutom möjliggjorde dessa analyser identifieringen av en ny metabolisk mekanism för tolerans mot Chagas sjukdom6. Tillämpa dessa metoder på studien av testning leishmaniasis visade betydande metaboliska störtben på platsen för lesion, men också specifika metaboliska förändringar i lesion-intilliggande, macroscopically friska vävnad. Till exempel var glutamin uttömda på lesion webbplats, medan glycerophosphocholines i m/z (massa till laddning förhållandet) 200-299, 400-499, 500-599 och 600-699 ökades avsevärt vid lesion webbplats. PC (O-34:1) ökades endast på lesion-intilliggande platser15.
Målet med detta manuskript är att visa de steg som krävs för att generera 3D-modeller av metabolitfördelning (“kemisk kartografi”) som tillämpas på trypanosomatid parasitinfektionsmodeller (figur 1). Detta tillvägagångssätt bygger på flera kritiska framsteg inom ramen för metabolomik och metabolomik databehandling, särskilt utvecklingen av ‘ili programvara för att plotta metabolomik data på 3D-modeller lätt16.
Att förstå trypanosomatid infektioner är viktigt för att vägleda nya läkemedelsutveckling och behandlingsmetoder. Denna kemiska kartografi metod är unikt redo att ge handlingsbara insikter i förhållandet mellan metabolism och trypanosomatid sjukdom patogenes, så att ta itu med detta translationella behov.
Endast lösningsmedel av LC-MS-kvalitet rekommenderas vid metabolitextraktion och MS-analyser för att minska bakgrundskontamineringen. Polymerförorening35, som vanligen härrör från paraffinfilm och/eller annan plast36,37,38, skall om möjligt undvikas. Särskilt parafilm får aldrig användas. Dessa aspekter är avgörande eftersom LC-MS-datakvaliteten beror på de material som används under provberedning och metabolitutvinning. Datakvaliteten bör säkerställas innan “ili-diagram” genereras. För att generera dessa omfattande rumsliga metabolomikkartor krävs dessutom insamling av alla intilliggande vävnadsprover och metabolitextraktion från alla insamlade prover för att undvika luckor i dessa kartor. Insamlingsförfaranden, logistik för metabolitutvinning och LC-MS-analys samt kostnader bör därför övervägas och planeras i enlighet därmed.
Det här protokollet kan ändras för att uppfylla användarnas behov på flera sätt. Till exempel kommer polariteten och lösligheten hos lösningsmedel som används under metabolitextraktion att påverka vilka metaboliter som detekteras39. För att maximera mångfalden av detekterade metabolitfunktioner för oriktade kemiska kartografianalyser rekommenderas kombination av flera extraktionssteg och lösningsmedel. Till exempel använder denna metod diklormetan, metanol och vatten som extraktionsmedel eftersom de möjliggör korrekt detektion av icke-polära och polära molekyler20,40. Dessa lösningsmedel är dock inte universellt lämpliga för varje MS-experiment, och forskare bör välja extraktionsmedel baserat på målen för deras projekt. På samma sätt kan olika LC-MS/MS-förhållanden användas, till exempel att ersätta bakåtfaskromatografi med normal faskromatografi. Alternativa kolumner kan också användas för insamling av data i omvänd fas istället för C8-kromatografi, men empiriskt är C8-kromatografi mer robust för vävnadslipider och har en lägre igensättningsfrekvens. Konceptuellt kan dessa protokoll också tillämpas på andra masspektrometrimetoder som gaskromatografi-masspektrometri etc.
Ett alternativt tillvägagångssätt är masspektrometri imaging. Till skillnad från masspektrometri imaging metoder, flytande kromatografi-mas spektrometri inte i sig bevara rumslig information10. Kemiska kartografimetoder överbryggar detta gap genom att inkludera provtagningsplats vid tidpunkten för projektets konceptualisering, i exempelmetadata och vid databehandlingssteg. En styrka i denna kemiska kartografimetod, till skillnad från masspektrometriavbildning, är förmågan att tillhandahålla självsäkra anteckningar (Metabolomics Standards Initiative nivå 1 eller nivå 2 anteckningsförtroende41), till skillnad från masspektrometriavbildning där huvuddelen av applikationerna förlitar sig på exakt massa endast för anteckning. Masspektrometriavbildning möjliggör finkornig rumslig kartläggning, ibland ner till encellsnivån, t.ex. 42,43. Däremot möjliggör kemiska kartografimetoder storskalig kartläggning av metabolitfördelning utan att kräva högspecialiserade kryosektionsfärdigheter för hela djur. Kemisk kartografi ger kompletterande bevis för de många rumsliga transkriptomiska metoder som utvecklas, t.ex. Alternativa metoder för parasitbelastningskvantifiering är mätning av bioluminescens vid tidpunkten för provtagningen6. Fina segment kan också samlas in för att göra det möjligt för konfokal eller elektronmikroskopi att bedöma lokaliserad parasitbörda och vävnadsskador. Vatten homogenatet, som används för cytokinkvantifiering i detta protokoll och tidigare publikationer13, kan också användas för att kvantifiera proteinbaserade markörer för vävnadsskador.
Det finns också flera sätt att få 3D-modeller som är lämpliga för att rita de resulterande LC-MS-data. Förutom den metod som föreslås här kan modeller köpas färdiga från olika onlineleverantörer. Se till att användarvillkoren överensstämmer med den avsedda användningen, särskilt när det gäller publicering. Modeller för stora organ kan genereras de novo med hjälp av 3D-skannrar enligt skannerinstruktioner. Alternativ som MATLAB finns för att generera och visualisera 3D-modeller för kemisk kartografi46, men de implementerades främst före utvecklingen av ‘ili16. MATLAB är en dataanalys- och programmeringsverktygssvit som erbjuder en mängd olika applikationer inom många områden. MATLAB är dock varken gratis eller öppen källkod, och det kräver förtrogenhet med MATLAB-gränssnitt, särskilt med tanke på att MATLAB inte utvecklades för bearbetning av masspektrometridata. Denna föreslagna metods alternativ, nämligen SketchUp, Meshlab och ‘ili, är fritt tillgängliga, användarvänliga och erbjuder liknande funktioner som MATLAB för kemiska kartografiändamål.
Denna metod är robust när det gäller provberedning och metabolitextraktion. Felsökning är oftast nödvändig i steget för datainsamling mellan LC och MS. Detta ligger utanför den här artikelns tillämpningsområde. Läsarna hänvisas till utmärkta publikationer om felsökning av LC-MS-datainsamling, inklusive20,47. På samma sätt ligger komplexiteten i metabolitanotering utanför ramen för denna metods fokus på 3D-modellgenerering. Användbara referenser om detta ämne inkluderar24,25,48,49.
Medan denna metod effektivt utforskar sjukdom patogenes, det finns begränsningar i detta tillvägagångssätt, av vilka några är vanliga i alla metabolomics experiment. En sådan begränsning är den låga anteckningsfrekvensen för LC-MS-funktioner50, som är beroende av referensspektralbibliotekens tillgänglighet och kvalitet. En ytterligare begränsning är att detta protokoll inte bevarar mRNA på grund av inkompatibiliteten hos RNA-konserveringsreagenser som RNAlater med LC-MS/MS-analys. Proteinkvaliteten är dock tillräcklig för nedströmsanalyser och kan därmed ersätta mRNA-baserade analyser.
En kemisk kartografi tillvägagångssätt för infektion patogenes återspeglar direkt hur bakteriella, virala eller parasitiska infektioner utvecklas i organsystem och orsakar lokaliserad sjukdom. Att analysera dessa regionala subsamples och generera 3D-modeller förmedlar i slutändan hur metaboliter fungerar över tredimensionellt utrymme och kastar ljus över dessa tidigare okända rumsliga dimensioner av molekylärbiologi. Med hjälp av detta protokoll, till exempel, metabolit lokalisering jämfördes med Trypanosoma cruzi parasit last. Resultaten klargjorde förhållandet mellan patogenen och värdvävnaden och visade också den metaboliska dynamiken i Chagas sjukdom symptom progression6. Kemiska kartografimetoder har också tillämpats på olika ämnen, såsom mänsklig byggd miljöinteraktion51,52,53, kemisk sammansättning av organsystem som mänsklig hud46 och lungor54 och växtmetabolism och miljöinteraktioner55. Framtida tillämpningar kan innebära bedömning av lokaliserad sjukdom tolerans och resiliens, eller förhållandet mellan lokala metabolit nivåer, patogen tropism och sjukdom tropism i modeller bortom trypanosomatid infektion. Detta tillvägagångssätt bör också ha bred tillämplighet att utöka nuvarande farmakokinetik protokoll, att bedöma förhållandet mellan lokala vävnad drognivåer och läkemedelsmetabolism kontra övergripande metaboliska sammanhang, vävnad skador och patogen clearance. Sammantaget möjliggör kemisk kartografi unika utforskningar av metabolitfördelningar i olika provtyper, med tillämpningar inklusive sjukdomspatogenes, människors hälsa, interaktioner mellan människa och miljö och mikrobiell dynamik.
The authors have nothing to disclose.
Laura-Isobel McCall, phD, innehar en utredare i Patogenesen för infektionssjukdomar från Burroughs Wellcome Fund. Författarna vill vidare erkänna stöd från NIH-tilldelningsnummer R21AI148886, ett pilotbidrag från Oklahoma Center for Respiratory and Infectious Diseases (OCRID) under NIH-tilldelningsnummer P20GM103648 och startfonder från University of Oklahoma (till LIM). Innehållet är enbart upphovsmännens ansvar och representerar inte nödvändigtvis finansiärernas officiella åsikter. Författarna vill också tacka utvecklarna av de verktyg som används i detta protokoll. Alla relevanta publikationer har i förekommande fall citerats.
1.5 mL Eppendorf tubes | NA | NA | any brand, as available |
1 L bottle, pyrex | NA | NA | any brand, as available |
1 L graduated cylinder, pyrex | NA | NA | any brand, as available |
2 mL SafeLock Eppendorf tubes | VWR | 20901-540 | use the appropriate tube model for the available tissue homogenizer |
3D model (de-novo generated according to protocol steps, or purchased) | NA | NA | as appropriate for system under investigation |
5 mm stainless steel bead | Qiagen | 69989 | |
96 well plate | Fisher | 3252449 | |
AATTCCTCCAAGCAGCGGATA primer | NA | NA | any brand, as available; published in Piron, M. et al. Development of a real-time PCR assay for Trypanosoma cruzi detection in blood samples. Acta tropica. 103 (3), 195–200 (2007). |
analytical balance | NA | NA | any brand, as available |
ASTCGGCTGATCGTTTTCGA primer | NA | NA | any brand, as available; published in Piron, M. et al. Development of a real-time PCR assay for Trypanosoma cruzi detection in blood samples. Acta tropica. 103 (3), 195–200 (2007). |
benchtop centrifuge with microcentrifuge, falcon tube and 96-well-plate capacity | NA | NA | any brand, as available |
biosafety cabinet | NA | NA | class II, type A2; any brand, as available |
CAGCAAGCATCTATGCACTTAG ACCCC primer |
NA | NA | any brand, as available; published in Cummings, K.L., Tarleton, R.L. Rapid quantitation of Trypanosoma cruzi in host tissue by real-time PCR. Molecular and biochemical parasitology. 129 (1), 53–59 (2003). |
camera | NA | NA | any brand, as available. A cellphone camera is adequate for this protocol |
chemiluminescent-capable imaging system | NA | NA | any system, as available |
cotton balls | NA | NA | any brand, as available |
cryogloves | VWR | 97008-208 | replace with any brand, as available |
dissection scissors | NA | NA | any brand, as available |
dry ice | NA | NA | any brand, as available |
extra-length forceps | NA | NA | any brand, as available |
flammable-grade refrigerator | NA | NA | any brand, as available |
freezer storage boxes for microcentrifuge tubes | NA | NA | any brand, as available |
fume hood | NA | NA | any brand, as available |
high-resolution mass spectrometer | NA | NA | any brand, as available, such as ThermoFisher Q-Exactive Plus (catalog number 0726030) |
ice bucket | NA | NA | any brand, as available |
ili software | ili.embl.de | NA | |
isoflurane | Covetrus | 29405 | |
large tupperware | NA | NA | any brand, as available; large enough to comfortably contain mouse, cotton ball |
LC-MS grade acetonitrile | Fisher Optima | A955-4 | |
LC-MS grade dicholoromethane | Fisher Optima | D151-4 | |
LC-MS grade formic acid | Fisher Optima | A11750 | |
LC-MS grade methanol | Fisher Optima | A456-4 | |
LC-MS grade water | Fisher Optima | W64 | |
liquid chromatography column | Phenomenex | 00B-4499-AN | may be changed to other brands and models as appropriate for the metabolites of interest |
liquid chromatography column guard cartridge | Phenomenex | AJ0-8784 | may be changed to other brands and models as appropriate for the metabolites of interest |
liquid chromatography column guard cartridge holder | Phenomenex | AJ0-9000 | may be changed to other brands and models as appropriate for the metabolites of interest |
liquid nitrogen | NA | NA | any brand, as available |
luciferin | Goldbio | LUCK-1G | |
MeshLab software | https://www.meshlab.net/ | NA | |
Meshmixer software | https://www.meshmixer.com/ | NA | |
MS calibrant | NA | NA | appropriate one for available instrument |
MS data processing software | NA | NA | multiple options available; authors recommend MZmine |
MSConvert software | http://proteowizard.sourceforge.net/ | NA | |
Nanodrop | ThermoFisher | ND-ONE-W | other nanodrop models are also suitable |
p1000 pipet tips | NA | NA | use the appropriate brand to fit available pipettors |
p1000 pipettor | NA | NA | any brand, as available |
p20 pipette tips | NA | NA | use the appropriate brand to fit available pipettors |
p20 pipettor | NA | NA | any brand, as available |
p200 pipette tips | NA | NA | use the appropriate brand to fit available pipettors |
p200 pipettor | NA | NA | any brand, as available |
personal protective equipment (gloves, lab coat, safety glasses/goggles; faceshield) | NA | NA | any brand, as available |
Q-Plex Mouse Cytokine – Screen (16-Plex) | Quansys biosciences | 110949MS | can replace with other protein-based cytokine assays such as other commercial cytokine ELISA kits |
Quick-DNA Miniprep Plus Kit (200 preps) | Zymo | D4069 | replace with any brand of mammalian DNA extraction kit, as available |
real-time thermocycler | NA | NA | any brand, as available |
salt shaker or tea infuser | NA | NA | any brand; to contain isoflurane-soaked cotton ball and prevent contact with mouse skin |
SketchUp software | https://www.sketchup.com/ | NA | |
specimen forceps | NA | NA | any brand, as available |
speedvac with microcentrifuge tube and 96-well-plate capacity | NA | NA | any brand, as available |
spreadsheet software | https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel | NA | can replace with other spreadsheet management software, as applicable |
sulfachloropyridazine | Sigma | S9882-100G | |
sulfadimethoxine | Sigma | S7007-10G | |
Sybr green qPCR reaction mix | Fisher | A25780 | can replace with other Sybr green qPCR reaction mixes, as desired |
TCCCTCTCATCAGTTCTAT GGCCCA primer |
NA | NA | any brand, as available; published in Cummings, K.L., Tarleton, R.L. Rapid quantitation of Trypanosoma cruzi in host tissue by real-time PCR. Molecular and biochemical parasitology. 129 (1), 53–59 (2003). |
tissue homogenizer | NA | NA | any brand, as available; for example, Qiagen TissueLyser II, catalog number 85300, with TissueLyser Adapter Set (2 x 24), catalog number 69982 |
tissue samples | NA | NA | from appropriate infection model |
TissueLyser single-bead dispenser | Qiagen | 69965 | |
UHPLC | NA | NA | any brand, as available, such as ThermoFisher Vanquish (catalog number IQLAAAGABHFAPUMBHV) |
ultra-low temperature freezer (-80) | NA | NA | any brand, as available |
ultrasonic bath | NA | NA | any system, as available |
wet ice | NA | NA | any brand, as available |
zone-free sealing film | VWR | 490007-390 |