Induzione di infarto miocardico e danno da ischemia-riperfusione miocardica nei topi

Summary

Qui descriviamo un metodo semplice e riproducibile che può indurre infarto miocardico o danno da ischemia-riperfusione miocardica nei topi mediante legatura di precisione dell’arteria coronaria discendente anteriore sinistra attraverso la micromanipolazione.

Abstract

L’infarto miocardico acuto è una malattia cardiovascolare comune con elevata mortalità. Il danno da riperfusione miocardica può contrastare gli effetti benefici del reflusso cardiaco e indurre un danno miocardico secondario. Un modello semplice e riproducibile di infarto miocardico e danno da ischemia-riperfusione miocardica è un buon strumento per i ricercatori. Qui, viene descritto un metodo personalizzabile per creare un modello di infarto del miocardio (MI) e MIRI mediante legatura di precisione dell’arteria coronaria discendente anteriore sinistra (LAD) attraverso la micromanipolazione. Il posizionamento accurato e riproducibile della legatura del LAD aiuta a ottenere risultati coerenti per le lesioni cardiache. Le modifiche del segmento ST possono aiutare a identificare l’accuratezza del modello. Il livello sierico di troponina T cardiaca (cTnT) viene utilizzato per valutare la lesione miocardica, l’ecografia cardiaca viene impiegata per valutare la funzione sistolica miocardica e la colorazione con cloruro di Evans-Blue/trifeniltetrazolio viene utilizzata per misurare le dimensioni dell’infarto. In generale, questo protocollo riduce la durata della procedura, garantisce dimensioni dell’infarto controllabili e migliora la sopravvivenza del topo.

Introduction

L’infarto miocardico acuto (IMA) è una malattia cardiovascolare comune in tutto il mondo e comporta un’elevata mortalità¹. I progressi nelle tecnologie rendono disponibile una rivascolarizzazione precoce ed efficace per i pazienti con IMA. Dopo questi trattamenti, in alcuni pazienti, può verificarsi un danno da ischemia-riperfusione miocardica (MIRI)². Pertanto, è di grande importanza comprendere i meccanismi delle azioni e come migliorare l’MI/MIRI. I topi sono ampiamente utilizzati come modelli a causa del loro basso costo, dei tempi di riproduzione rapidi e della facilità di apportare alterazioni genetiche³. Gli studiosi hanno sviluppato diversi metodi per modellare MIRI e MI negli animali 4,5,6,7,8,9. Questa strategia promuove la ricerca, ma i diversi criteri e metodi utilizzati complicano l’interpretazione dei risultati tra i gruppi di ricerca.

Nei topi, l’infarto miocardico è stato indotto dall’isoproterenolo 10, dalla criolesione^11,12 o dalla cauterizzazione¹³. L’infarto miocardico può essere indotto prontamente dall’isoproterenolo, ma il processo fisiopatologico è diverso da quello dell’infarto miocardico clinico. L’infarto miocardico indotto da criolesione ha una scarsa consistenza, provoca un eccessivo danno miocardico intorno all’arteria coronaria discendente anteriore sinistra (LAD) e può facilmente indurre aritmia. L’infarto miocardico indotto dalla cauterizzazione è molto diverso dal processo naturale dell’infarto del miocardio e la reazione infiammatoria nell’area in fiamme è più intensa; Inoltre, l’approccio chirurgico presenta difficoltà tecniche. Inoltre, ci sono alcuni laboratori¹⁴ che stanno sviluppando un modello di infarto miocardico in minipig utilizzando il blocco del palloncino o l’embolizzazione o il metodo della trombosi attraverso tecniche interventistiche. Tutte queste metodiche possono causare direttamente l’occlusione delle arterie coronarie, ma la necessità di dispositivi per angiografia coronarica e, soprattutto, le arterie coronarie di topo troppo sottili rende queste operazioni poco pratiche. Per MIRI, le differenze tra i diversi modelli erano piuttosto modeste, come l’uso di respiratori/micromanipolazione o meno ^5,6.

Qui viene descritto un metodo semplice e affidabile in grado di indurre l’infarto miocardico e il modello MIRI, adattato dai metodi 4,5,6,7,8,9,15 precedentemente pubblicati. Questo metodo può simulare i processi fisiopatologici mediante il blocco diretto del LAD attraverso la legatura. Inoltre, alleviando la legatura, questo modello può anche simulare il danno da riperfusione. In questo protocollo, viene utilizzato un microscopio da dissezione per la visualizzazione LAD. Quindi, il ricercatore può identificare prontamente il LAD. Successivamente, un’accurata legatura del LAD porta a un’occlusione del sangue e a un’ischemia ventricolare riproducibili e prevedibili. Inoltre, le alterazioni dell’elettrocardiogramma (ECG) possono essere utilizzate per confermare l’ischemia e la riperfusione, oltre ai cambiamenti di colore del LAD osservati al microscopio. Questa strategia porta a una durata della procedura più breve, a un minor rischio di complicanze chirurgiche e a un minor numero di topi sperimentali necessari. Vengono inoltre descritti i metodi per il test della troponina-T, l’ecografia cardiaca e la colorazione del cloruro di trifeniltetrazolio (TTC). Nel complesso, questo protocollo è utile per gli studi sul meccanismo MI/MIR, nonché per la scoperta di farmaci.

Protocol

Gli studi sugli animali sono stati approvati dal Comitato per la cura e l’utilizzo degli animali dell’Università di Scienza e Tecnologia di Huazhong (Wuhan, Cina). NOTA: I topi maschi C57BL/6J (8-10 settimane) sono usati come modelli. I topi hanno libero accesso al cibo e all’acqua e vengono allevati in specifiche condizioni prive di agenti patogeni. L’ambiente viene mantenuto a temperatura controllata (22 °C ± 2 °C) e umidità (45%-65%). I topi sono esposti a un ambiente chiaro/buio di 12…

Representative Results

Il flusso di lavoro sperimentale è illustrato nella Figura 1A. Il ricercatore può programmare i nodi temporali in base al disegno sperimentale all’inizio dello studio. La durata della legatura LAD è in base allo scopo della ricerca. Per l’infarto miocardico, la ricerca può ignorare la fase di riperfusione. L’ecografia cardiaca è disponibile in diverse fasi dello studio perché non è invasiva, mentre la colorazione Evans-Blue/TTC può essere eseguita solo quando il topo viene sacrificat…

Discussion

Negli ultimi anni, la creazione di modelli per MI e MIRI nella ricerca clinica e scientifica si è sviluppata rapidamente^20,21. Tuttavia, ci sono ancora alcune questioni, come i meccanismi d’azione e come migliorare l’MI/MIRI, che devono essere risolte. Qui viene descritto un protocollo modificato per stabilire un modello murino di MI e MIRI. Diversi punti chiave devono essere considerati attentamente.

Il primo punto chiave è l’intuba…

Materials

0.9 % sodium chloride solution	Kelun Industry Group,China		–
4% paraformaldehyde fixing solution	Servicebio,China	G1101	–
4-0 silk suture	Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products,China	C412	–
8-0 suture	Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products,China	H801	–
Buprenorphine	IsoReag,China	IR-11190	–
Camera	Canon,Japan	EOS 80D	–
Depilatory cream	Veet,French		–
Elecsys Troponin T hs STAT	Roche,Germany		–
Electrochemical luminescence immunoanalyzer	Roche,Germany	Elecsys 2010	–
Evans blue	Sigma,America	E2129	–
Eye scissors	Shanghai Medical Instruments,China	JC2303	–
Haemostatic forceps	Shanghai Medical Instruments,China	J31020	–
High frequency in vivo imaging systems	Visualsonics,Canada	Vevo2100	–
Ibuprofen	PerFeMiKer,China	CLS-12921	–
Intravenous catheter	Introcan,Germany	4254090B	–
Ketamine	Sigma-Aldrich,America	K2753	–
Medical alcohol	Huichang ,China		–
Microneedle holders	Shanghai Medical Instruments,China	WA2040	–
Microscopic shears	Shanghai Medical Instruments,China	WA1040	–
Microsurgical forceps	Shanghai Medical Instruments,China	WA3020	–
Mouse electrocardiograph	Techman,China	BL-420F	–
Needle holders	Shanghai Medical Instruments,China	JC3202	–
operating floor	Chico,China	ZK-HJPT	–
PE-10 tube	Huamei,China		–
Pentobarbital	Merck,America	1030001	–
Rodent Ventilator	Shanghai Alcott Biotech,China	ALC-V8S-P	–
Stereo microscope	Aomei Industry,China	SZM0745-STL3-T3	–
Surgical thermostatic heating pad	Globalebio, China	GE0-20W	–
Triphenyltetrazolium chloride	Servicebio,China	G1017	–
Xylazine	Huamaike Biochemicals and Life Science Research Prouducts,China	323004	–