Visualisering och kvantifiering av farmaceutiska föreningar i huden med hjälp av koherent Raman Scattering Imaging
Summary
En sammanhängande Raman-spridningsmetodik för att visualisera och kvantifiera farmaceutiska föreningar i huden beskrivs. Detta dokument beskriver hudvävnadsberedning (människa och mus) och topisk formuleringsapplikation, bildförvärv för att kvantifiera spatiotemporala koncentrationsprofiler och preliminär farmakokinetisk analys för att bedöma topisk läkemedelsleverans.
Abstract
Kutan farmakokinetik (cPK) efter topikal formuleringsapplikation har varit ett forskningsområde av särskilt intresse för regulatoriska och läkemedelsutvecklingsforskare att mekaniskt förstå topikal biotillgänglighet (BA). Semi-invasiva tekniker, såsom bandstrippning, dermal mikrodialys eller dermal mikroperfusion med öppet flöde, kvantifierar alla cPK i makroskala. Medan dessa tekniker har gett stor cPK-kunskap, saknar samhället en mekanistisk förståelse för aktiv farmaceutisk ingrediens (API) penetration och permeation på cellulär nivå.
Ett icke-invasivt tillvägagångssätt för att ta itu med mikroskala cPK är koherent Raman scattering imaging (CRI), som selektivt riktar sig mot inneboende molekylära vibrationer utan behov av yttre etiketter eller kemisk modifiering. CRI har två huvudmetoder – koherent anti-Stokes Raman-spridning (CARS) och stimulerad Raman-spridning (SRS) – som möjliggör känslig och selektiv kvantifiering av API: er eller inaktiva ingredienser. CARS används vanligtvis för att härleda strukturell hudinformation eller visualisera kemisk kontrast. Däremot används SRS-signalen, som är linjär med molekylär koncentration, för att kvantifiera API: er eller inaktiva ingredienser inom hudstratifieringar.
Även om musvävnad ofta har använts för cPK med CRI, måste topikal BA och bioequivalens (BE) i slutändan bedömas i mänsklig vävnad innan myndighetsgodkännande. Detta dokument presenterar en metod för att förbereda och avbilda ex vivo-hud som ska användas i kvantitativa farmakokinetiska CRI-studier vid utvärdering av topikal BA och BE. Denna metod möjliggör tillförlitlig och reproducerbar API-kvantifiering inom människas och mushud över tid. Koncentrationerna inom lipidrika och lipidfattiga fack samt total API-koncentration över tid kvantifieras; dessa används för uppskattningar av mikro- och makroskala BA och, potentiellt, BE.
Introduction
Metoderna för att bedöma cPK efter topikal läkemedelsprodukttillämpning har utvidgats från klassiska IVPT-studier (in vitro permeation testing) 1,2,3,4,5 och bandstrippning 6,7,8 till ytterligare metoder såsom mikroperfusion med öppet flöde eller dermal mikrodialys 9,10,11. 12,13,14. Det finns potentiellt olika lokala platser för terapeutisk verkan beroende på sjukdomen av intresse. Därför kan det finnas ett motsvarande antal metoder för att bedöma hur mycket och i vilken utsträckning ett API kommer till den avsedda lokala åtgärdsplatsen. Medan var och en av de ovannämnda metoderna har sina fördelar, är den största nackdelen bristen på mikroskala cPK-information (dvs. oförmågan att visualisera var API: et går och hur det genomsyrar).
En icke-invasiv metod av intresse för att uppskatta topisk BA och BE är CRI, som kan delas upp i två bildmetoder: CARS och SRS-mikroskopi. Dessa koherenta Raman-metoder möjliggör kemiskt specifik avbildning av molekyler via icke-linjära Raman-effekter. I CRI fokuseras och skannas två laserpulståg i ett prov; skillnaden i energi mellan laserfrekvenserna är inställd på att rikta in sig på vibrationslägen som är specifika för de kemiska strukturerna av intresse. Eftersom CRI-processer är olinjära genereras en signal endast vid mikroskopfokuseringen, vilket möjliggör tredimensionell farmakokinetisk tomografisk avbildning av vävnaden. I samband med cPK har CARS använts för att erhålla vävnadsstrukturell information, såsom placeringen av lipidrika hudstrukturer15. Däremot har SRS använts för att kvantifiera molekylär koncentration eftersom dess signal är linjär med koncentration. För ex vivo-hudprover är det fördelaktigt att utföra CARS i epi-riktningen16 och SRS i överföringsläge17. Därför kommer vävnadsprover som är tunna att möjliggöra SRS-signaldetektering och kvantifiering.
Som modellvävnad presenterar det nakna musörat flera fördelar med mindre nackdelar. En fördel är att vävnaden redan är ~ 200-300 μm i tjocklek och inte kräver ytterligare provberedning. Dessutom ses flera hudstratifieringar genom att axiellt fokusera genom ett synfält (t.ex. stratum corneum, talgkörtlar (SG), adipocyter och subkutant fett)16,18. Detta möjliggör preliminär preklinisk uppskattning av kutana permeationsvägar och aktuella BA-uppskattningar innan de flyttas till mänskliga hudprover. Nakenmusmodellen presenterar dock begränsningar som svårigheter att extrapolera till in vivo-scenarier på grund av skillnader i hudstruktur19. Medan det nakna musörat är en utmärkt modell för att få preliminära resultat, är den mänskliga hudmodellen guldstandarden. Även om det har förekommit olika kommentarer om lämpligheten och tillämpligheten av frusen mänsklig hud för att exakt rekapitulera in vivo permeationskinetik 20,21,22, är användningen av frusen mänsklig hud en accepterad metod för utvärdering av in vitro API-permeationskinetik 23,24,25 . Detta protokoll visualiserar olika hudlager i mus och mänsklig hud samtidigt som API-koncentrationer inom lipidrika och lipidfattiga strukturer kvantifieras.
Medan CRI har använts inom många områden för att specifikt visualisera föreningar i vävnader, har det varit begränsade ansträngningar att undersöka cPK för topiskt applicerade läkemedelsprodukter. För att utvärdera den aktuella BA / BE för aktuella produkter med CRI är det nödvändigt att först ha ett standardiserat protokoll på plats för att göra exakta jämförelser. Tidigare försök att använda CRI för läkemedelsleverans till huden har visat variation i data. Eftersom detta är en relativt ny tillämpning av CRI är det viktigt att upprätta ett protokoll för att få tillförlitliga resultat 18,26,27. Detta tillvägagångssätt riktar sig endast till ett specifikt vågtal i den biologiska tysta regionen i Raman-spektrumet. De flesta API: er och inaktiva ingredienser har dock Raman-skift inom fingeravtrycksregionen. Detta har tidigare inneburit utmaningar på grund av den inneboende signalen som härrör från vävnaden i fingeravtrycksområdet. De senaste laser- och beräkningsframstegen har tagit bort denna barriär, som också kan användas i kombination med det tillvägagångssätt som presenteras här28. Detta tillvägagångssätt som presenteras här möjliggör kvantifiering av ett API, som har ett Raman-skift i den tysta regionen (2 000-2 300 cm-1). Detta är inte begränsat till läkemedlets fysiokemiska egenskaper, vilket kan vara fallet för vissa tidigare nämnda cPK-övervakningsmetoder29.
Protokollet måste minska variationen i hudtjocklek från prov till prov för olika preparat, eftersom tjocka mänskliga hudprover kommer att ge minimal signal efter applicering av läkemedelsprodukten på grund av ljusspridning av det tjocka provet. Ett mål med detta manuskript är att presentera en vävnadsberedningsmetodik som säkerställer reproducerbara bildstandarder. Dessutom är CRI-systemet inställt enligt beskrivningen för att minska potentiella felkällor samt minimera signal-till-brus. Detta dokument kommer dock inte att diskutera de vägledande principerna och tekniska fördelarna med CRI-mikroskopet eftersom detta tidigare har behandlats30. Slutligen undersöks det omfattande dataanalysförfarandet för att möjliggöra tolkning av resultaten för att bestämma ett experiments framgång eller misslyckande.
Protocol
Representative Results
Discussion
Utvärderingen av topikal BA / BE är ett forskningsområde som kräver ett mångfacetterat tillvägagångssätt eftersom ingen enskild metod fullt ut kan karakterisera in vivo cPK. Detta protokoll presenterar en metod för utvärdering av en topikal läkemedelsprodukts BA / BE baserat på sammanhängande Raman-avbildning. En av de första punkterna som kan förbises är hur tunna hudproverna måste vara, särskilt för kvantitativ överföring SRS-avbildning. Om huden är för tjock (dvs . ljus kan int…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka Dr. Fotis Iliopoulos och Daniel Greenfield från Evans ‘Group för deras diskussion och korrekturläsning av detta manuskript. Dessutom vill författarna erkänna stöd från LEO Pharma. Figur 2 skapades med BioRender.com.
Materials
| Tissue Preparation | |||
| Autoclavable Biohazard Bags | FisherBrand | 22-044562 | As refered to in text: biohazard bags https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-polyethylene-biohazard-autoclave-bags-without-sterilization-indicator-8/22044562?searchHijack=true&searchTerm= 22044562&searchType=RAPID& matchedCatNo=22044562 |
| Cell Culture Buffers: Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1x | Corning | MT21030CV | As refered to in text: PBS https://www.fishersci.com/shop/products/corning-cellgro-cell-culture-buffers-dulbecco-s-phosphate-buffered-salt-solution-1x-8/MT21030CV?searchHijack=true&searchTerm= 21-030-cv&searchType= RAPID&matchedCatNo=21-030-cv |
| Disposable Scalpels | Exel International | 14-840-00 | As refered to in text: scalpel https://www.fishersci.com/shop/products/exel-international-disposable-scalpels-3/1484000?keyword=true |
| High Precision 45° Angle Broad Point Tweezers/Forceps | Fisherbrand | 12-000-132 | As refered to in text: forceps https://www.fishersci.com/shop/products/high-precision-45-angle-broad-point-tweezers-forceps/12000132#?keyword= |
| Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-Ply | Kimberly-Clark Professional Kimtech Science | 06-666 | As refered to in text: task wiper https://www.fishersci.com/shop/products/kimberly-clark-kimtech-science-kimwipes-delicate-task-wipers-7/06666 |
| Parafilm M Laboratory Wrapping Film | Bemis | 13-374-12 | As refered to in text: parafilm https://www.fishersci.com/shop/products/curwood-parafilm-m-laboratory-wrapping-film-4/1337412 |
| Petri Dish (35 mm x 10 mm) | Fisherbrand | FB0875711YZ | As refered to in text: small petri dish https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-specialty-6/FB0875711YZ?keyword=true |
| Petri Dish (60 mm x 15 mm) | Fisherbrand | FB0875713A | As refered to in text: large petri dish https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/FB0875713A?keyword=true |
| Surgical Scissors | Roboz | NC9411473 | As refered to in text: scissors https://www.fishersci.com/shop/products/scissors-327/NC9411473?searchHijack=true&searchTerm= RS-5915SC&searchType=RAPID& matchedCatNo=RS-5915SC |
| Laser/microscope | |||
| 650/60 nm BrightLine single-band bandpass filter | Semrock | As refered to in text: CARS filter – CH2 vibrations (645nm/60nm filter) | |
| Control box IX2-UCB | Olympus | As refered to in text: Control Box | |
| D700/30m | Chroma | As refered to in text: CARS filter – deuterated band https://www.chroma.com/products/parts/d700-30m |
|
| DeepSee Insight | Spectra-Physics | As refered to in text: Laser https://www.spectra-physics.com/f/insight-x3-tunable-laser |
|
| Digital Handheld Optical Power and Energy Meter Console | ThorLabs | PM100D | As refered to in text: power meter https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=3341 |
| Fluoview Software | Olympus | As refered to in text: Microscope Control software | |
| Frosted Microscope Slides | FisherBrand | As refered to in text: microscope slides https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-frosted-microscope-slides-4/22265446 |
|
| FV1000 | Olympus | As refered to in text: Microscope | |
| Incubation Chamber | Tokai Hit | GM-800 | As refered to in text: incubation chamber |
| Integrating Sphere Photodiode Power Sensor | ThorLabs | S142C | As refered to in text: photodiode https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=3341 |
| Power supply FV31-PSU | Olympus | As refered to in text: Power Supply | |
| Precision 4063, 80MHz Dual Channel Function Generator | BK Precision | As refered to in text: function generator | |
| ProScan – Precision Microscope Automation | Prior Scientific Instruments | As refered to in text: stage controller https://www.prior.com/microscope-automation/inverted-microscope-systems/proscan-linear-stage-highest-precision-microscope-automation |
|
| SecureSeal Imaging Spacers | Grace Biolabs | 654004 | As refered to in text: spacer https://gracebio.com/product/secureseal-imaging-spacers-654004/ |
| SRS Detection Kit | APE | As refered to in text: SRS detector | |
| UPLSAPO 20X NA:0.75 | Olympus | As refered to in text: 20X Objective https://www.olympus-lifescience.com/en/objectives/uplsapo/ |
|
| Lipid/Drug Imaging | |||
| 35 mm Dish, No. 0 Uncoated Coverslip, 14 mm Glass Diameter | MatTek Corporation | NC9711297 | As refered to in text: Glass bottom dish https://www.fishersci.com/shop/products/glass-bottom-mircrowell-dish/nc9711297 |
| Cotton-tipped applicators | FisherBrand | As refered to in text: Cotton-tipped applicator | |
| Distriman Postive Displacement Pipette | Gilson | As refered to in text: Postive Displacement Pipette https://www.fishersci.com/shop/products/gilson-distriman-positive-displacement-repetitive-pipette/F164001G#?keyword= |
|
| Distriman Postive Displacement Pipette Tips | Gilson | As refered to in text: Tips for pipette https://www.fishersci.com/shop/products/gilson-distritip-syringes-6/f164100g?keyword=true |
|
| Data Analysis | |||
| FIJI | Open-source | As refered to in text: FIJI/ImageJ https://imagej.net/software/fiji/ |
|
| Jupyter-Lab | open-source | As refered to in text: JupyterLab https://jupyter.org/ |
|
| Rstudio | Open-source | As refered to in text: Rstudio https://www.rstudio.com/ |
Riferimenti
- Finnin, B., Walters, K. A., Franz, T. J., Benson, H. E., Watkinson, A. C. In vitro skin permeation methodology. In Transdermal and topical drug delivery: principles and methodology. Transdermal and topical drug delivery: principles and practice. , 85-108 (2012).
- Shin, S. H., et al. On the road to development of an in vitro permeation test (IVPT) model to compare heat effects on transdermal delivery systems: exploratory studies with nicotine and fentanyl. Pharmaceutical Research. 34 (9), 1817-1830 (2017).
- Hossain, A., et al. Preparation, characterisation, and topical delivery of terbinafine. Pharmaceutics. 11 (10), 548 (2019).
- Santos, L. L., Swofford, N. J., Santiago, B. G. In vitro permeation test (IVPT) for pharmacokinetic assessment of topical dermatological formulations. Current Protocols in Pharmacology. 91 (1), 79 (2020).
- Iliopoulos, F., Caspers, P. J., Puppels, G. J., Lane, M. E. Franz cell diffusion testing andquantitative confocal Raman spectroscopy: In vitro-in vivo correlation. Pharmaceutics. 12 (9), 887 (2020).
- Cordery, S., et al. Topical bioavailability of diclofenac from locally-acting, dermatological formulations. International Journal of Pharmaceutics. 529 (1-2), 55-64 (2017).
- Pensado, A., et al. Stratum corneum sampling to assess bioequivalence between topicalacyclovir products. Pharmaceutical Research. 36 (12), 1-16 (2019).
- Zhang, Y., et al. Dermal delivery of niacinamide-in vivo studies. Pharmaceutics. 13 (5), 726 (2021).
- Bodenlenz, M., et al. Open flow microperfusion as a dermal pharmacokinetic approach to evaluate topical bioequivalence. Clinical Pharmacokinetics. 56 (1), 91-98 (2017).
- Eirefelt, S., et al. Evaluating dermal pharmacokinetics and pharmacodymanic effect of soft topical PDE4 inhibitors:Open flow microperfusion and skin biopsies. Pharmaceutical Research. 37 (12), 1-12 (2020).
- Stagni, G., O’Donnell, D., Liu, Y. J., Kellogg, J. D. L., Shepherd, A. M. Iontophoretic current and intradermal microdialysis recovery in humans. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 41 (1), 49-54 (1999).
- Garcia Ortiz, P., Hansen, S. H., Shah, V. P., Menne, T., Benfeldt, E. Impact of adultatopic dermatitis on topical drug penetration: assessment by cutaneous microdialysis and tape stripping. Acta Dermato-Venereologica. 89 (1), 33-38 (2009).
- Joshi, A., Patel, H., Joshi, A., Stagni, G. Pharmacokinetic applications of cutaneous microdialysis: Continuous+intermittent vs continuous-only sampling. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 83, 16-20 (2017).
- Kuzma, B. A., et al. Evaluation of local bioavailability of metronidazole from topical formulations using dermal microdialysis: Preliminary study in a Yucatan mini-pig model. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 159, 105741 (2021).
- Begley, R., Harvey, A., Byer, R. L.Coherent anti-Stokes Raman spectroscopy. Applied Physics Letters. 25 (7), 387-390 (1974).
- Evans, C. L., et al. Chemical imaging of tissue in vivo with video-rate coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (46), 16807-16812 (2005).
- Hill, A. H., Manifold, B., Fu, D. Tissue imaging depth limit of stimulated Raman scattering microscopy. Biomedical Optics Express. 11 (2), 762-774 (2020).
- Feizpour, A., Marstrand, T., Bastholm, L., Eirefelt, S., Evans, C. L. Label-free quantification of pharmacokinetics in skin with stimulated Raman scattering microscopy and deep learning. Journal of Investigative Dermatology. 141 (2), 395-403 (2021).
- Ghosh, B., Reddy, L. H., Kulkarni, R. V., Khanam, J. Comparison of skin permeability of drugs in mice and human cadaver skin. Indian Journal of Experimental Biology. 38 (1), 42-45 (2000).
- Nielsen, J. B., Plasencia, I., Sørensen, J. A., Bagatolli, L. Storage conditions of skin affect tissue structure and subsequent in vitro percutaneous penetration. Skin Pharmacology and Physiology. 24 (2), 93-102 (2011).
- Barbero, A. M., Frasch, H. F. Effect of frozen human epidermis storage duration and cryoprotectant on barrier function using two model compounds. Skin Pharmacology and Physiology. 29 (1), 31-40 (2016).
- Babu, R., et al. The influence of various methods of cold storage of skin on the permeation of melatonin and nimesulide. Journal of Controlled Release. 86 (1), 49-57 (2003).
- Skelly, J. P., et al. FDA and AAPS report of the workshop on principles and practices of in vitro percutaneous penetration studies: relevance to bioavailability and bioequivalence. Pharmaceutical Research. 4 (3), 265-267 (1987).
- OECD. Guidance document for the conduct of skin absorption studies. OECD. , (2004).
- OECD. Test no. 428: Skin absorption: In vitro method. OECD. , (2004).
- Saar, B. G., et al. Video-rate molecular imaging in vivo with stimulated Raman scattering. Science. 330 (6009), 1368-1370 (2010).
- Saar, B. G., Contreras-Rojas, L. R., Xie, X. S., Guy, R. H. Imaging drug delivery to skin with stimulated Raman scattering microscopy. Molecular Pharmaceutics. 8 (3), 969-975 (2011).
- Pence, I. J., Kuzma, B. A., Brinkmann, M., Hellwig, T., Evans, C. L. Multi-windowsparse spectral sampling stimulated Raman scattering microscopy. Biomedical Optics Express. 12 (10), 6095-6114 (2021).
- Herkenne, C., et al. In vivo methods for the assessment of topical drug bioavailability. Pharmaceutical Research. 25 (1), 87-103 (2008).
- Alfonso-Garcıa, A., Mittal, R., Lee, E. S., Potma, E. O. Biological imaging with coherent Raman scattering microscopy: a tutorial. Journal of Biomedical Optics. 19 (7), 071407 (2014).
- Osseiran, S., et al. Longitudinal monitoring of cancer cell subpopulations in monolayers, 3D spheroids, and xenografts using the photoconvertible dye DiR. Scientific Reports. 9 (1), 1-10 (2019).
- Evennett, P. Kohler illumination: a simple interpretation. Proceedings of the Royal Microscopical Society. 28 (4), 189-192 (1983).
- Sanderson, J. Fundamentals of microscopy. Current Protocols in Mouse Biology. 10 (2), 76 (2020).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Hunter, J. D. Matplotlib: A 2D graphics environment. Computing in Science & Engineering. 9 (3), 90-95 (2007).
- Wickham, H. . ggplot2: Elegant Graphics for Data Analysis. , (2016).
- Kim, H., Han, S., Cho, Y. S., Yoon, S. K., Bae, K. Development of R packages:’Non-Compart’ and ‘ncar’ for noncompartmental analysis (NCA). Translational and Clinical Pharmacology. 26 (1), 10-15 (2018).
