Oral administrering av dsRNA produsert av bakterier, en leveringsmetode for RNA-interferens (RNAi) som rutinemessig brukes i Caenorhabditis elegans, ble vellykket brukt her på voksne mygg. Vår metode muliggjør robuste omvendte genetikkstudier og overføringsblokkerende vektorstudier uten bruk av injeksjon.
RNA-interferens har vært et tungt brukt verktøy for omvendt genetisk analyse i to tiår. I voksne mygg har dobbeltstrenget RNA (dsRNA) administrasjon blitt oppnådd hovedsakelig via injeksjon, noe som krever betydelig tid og ikke er egnet for feltapplikasjoner. For å overvinne disse begrensningene, her presenterer vi en mer effektiv metode for robust aktivering av RNAi ved muntlig levering av dsRNA til voksne Anopheles gambiae. Lange dsRNAer ble produsert i Escherichia coli stamme HT115 (DE3), og en konsentrert suspensjon av varme-drepte dsRNA-inneholdende bakterier i 10% sukrose ble tilbudt på bomull baller ad-libitum til voksne mygg. Bomullskuler ble erstattet hver annen dag i løpet av behandlingen. Bruk av denne metoden for å målrette doublesex (et gen involvert i kjønnsdifferensiering) eller gaffelhode (som koder en spyttkjerteltranskripsjonsfaktor) resulterte i redusert målgenuttrykk og / eller proteinimmunofluorescenssignal, målt ved kvantitativ sanntids PCR (qRT-PCR) eller fluorescens konfokal mikroskopi, henholdsvis. Defekter i spyttkjertelmorfologi ble også observert. Denne svært fleksible, brukervennlige, rimelige, tidseffektive metoden for dsRNA-levering kan være bredt anvendelig for målgener som er viktige for insektvektorfysiologi og utover.
Mange sykdommer overføres av mygg, noe som gjør studiet av myggfysiologi og genetikk til et viktig foretak. Bruken av RNAi i disse organismene har vært fremtredende de siste 20 årene og har tillatt funksjonell karakterisering av mange mygggener 1,2,3,4,5. Den mest brukte teknikken for dsRNA-levering har vært mikroinjeksjon, som har ulempene at den kan skade myggene og krever betydelig tid og krefter. Oral leveringsmetoder for RNAi har blitt testet, men hovedsakelig i larvestadiet av myggene 6,7,8,9. Oral levering av dsRNA i voksne mygg har ikke blitt fullstendig utforsket og kan være et nyttig verktøy for studiet av vektorbiologi og vektorstyring.
Malaria overføres av Anopheles mygg når en infisert kvinnelig mygg tar et blodmåltid fra en uinfisert vert og injiserer spytt som inneholder malarial parasitter10. For å til slutt bli overført i spytt av en mygg, må parasitten overvinne mange hindringer, inkludert å unngå mygg immunforsvaret, traversering av midgutbarrieren og invasjon av spyttkjertlene11. Mygg spyttkjertel (SG) arkitektur er nøkkelen til parasitt invasjon og at arkitektur styres både av viktige spyttkjertel-uttrykte transkripsjonsfaktorer samt determinanter av seksuell dimorfisme. Flere svært konserverte transkripsjonsfaktorer er nødvendige for cellulær spesifikasjon og homeostatisk vedlikehold av spyttkjertlene og for produksjon og sekresjon av spyttproteiner som fungerer i blodfôring 12,13,14. Gaffelhode (Fkh) er en bevinget helix transkripsjonsfaktor som fungerer som en stor regulator av insekt SG struktur og funksjon (basert på studier i fruktfluer og silkeormmot)15,16,17,18,19,20. I Drosophila SGs fungerer Fkh med Sage, en SG-spesifikk grunnleggende helix-loop-helix (bHLH) transkripsjonsfaktor, for å fremme SG-overlevelse og spyttproduksjon19. En viktig, positiv medregulator for spyttproduksjon i Drosophila er CrebA, en godt studert leucin glidelås transkripsjon faktor som oppregulerer uttrykket av sekretoriske veigener 21,22,23. Det er også en sterk grad av morfologisk differensiering i kvinnelige spyttkjertler som sannsynligvis spiller en nøkkelrolle, ikke bare i blodfôring, men også i parasittenes evne til å invadere dette vevet24.
Mange av genene som er involvert i å bestemme spyttkjerteloverlevelse, struktur, fysiologi og seksuell dimorfisme har komplekse romlige uttrykksprofiler 25,26,27, og de tradisjonelle leveringsmetodene til dsRNA for å indusere RNAi er ikke alltid effektive til å målrette mot denne typen gener i dette eller andre vev. Imidlertid har oral levering av dsRNA i larvalstadiet Aedes aegypti og An. gambiae mygg blitt brukt med hell for å kneble den kvinnespesifikke formen av dsx-genet 9,28. Tidligere studier med dsRNA i mygg spyttkjertler fant at selv om store mengder dsRNA var nødvendig, var silencingeffekten relativt langvarig (minst 13 dager)29. Her ble evnen til varme-drept E. coli-stamme HT115 (DE3) som uttrykker sekvensspesifikk dsRNA for dsx, fkh eller CrebA for å indusere RNAi-silencing av disse genene i voksne kvinnelige mygg testet. Oral administrering av dsRNA indusert gen knockdown i An. gambiae, med klare reduksjoner i mRNA nivåer og med fenotyper i samsvar med tap av funksjon av disse genene. Dermed vil denne tilnærmingen sannsynligvis fungere for å slå ned funksjonen til en rekke spyttkjertelgener.
Evnen til effektivt å levere dsRNA til An. gambiae mygg ved oral fôring har brede implikasjoner for studier av vektorbiologi både i laboratoriet og i feltet. Mikroinjeksjon har lenge vært akseptert som den foretrukne leveringsmåten for kjemikalier, antistoffer, RNAi og genetiske modifikasjonsstrategier i mygg43,44. Konsekvensen av betydelig fysisk manipulasjon, cellulær skade og stress kan unngås ved bruk av oral levering, som også kan være potensielt egnet for store eller feltapplikasjoner. Tidligere arbeid har antydet at RNAi virker allestedsnærværende i en individuell voksen mygg29, noe som gir effekter i alle vev, inkludert spyttkjertler. Ved å mate mygg med et stort antall dsRNA-uttrykkende E. coli som fordøyes asynkront over lang tid, kan man potensielt oppnå konsistent og jevn eksponering for RNAi på tvers av alle individer i et bur. Denne metoden gjør det mulig å mate et stort antall mygg og analysere potensiell variasjon av de resulterende fenotypene avhengig av målgenet. En viktig vurdering er imidlertid muligheten for heterogen fordeling av bakteriene, og dermed dsRNA, i bomullsfiberen. De 400 μL bakteriene som brukes daglig til myggsukkerfôring, vil inneholde omtrent ≤4,6 μg dsRNA, som beskrevet og beregnet tidligere9, men mengden dsRNA inntatt av hver mygg ble ikke individuelt bestemt. Hvis bygging av dsRNA-konstruksjoner blir rutine, gir denne enkle behandlingsprotokollen rask assimilering av denne teknikken av enhver myggforsker. A priori, tidsutgiftene under behandling (30 min per dag) er trivielle sammenlignet med tiden det tar å lære og bruke mikroinjeksjon på lignende utvalgsstørrelser.
Feeding dsRNA brukes rutinemessig til omvendte genetikkstudier i modellorganismen Caenorhabditis elegans45. Dette tunge bruksnivået understreker verdien av den muntlige leveringsmåten. Bygging av et An. gambiae genom-bredt bibliotek i transformert E. coli, lik det som eksisterer i C. elegans46,47, ville tillate rask omvendt genetisk screening i mygg i økt skala. Det er imidlertid viktig å merke seg at effektiviteten av metoden avhenger i stor grad av de endogene nivåene av transkripsjon, og hvis uttrykket ikke er begrenset til målvevet, men uttrykt mer bredt 4,8,44. I tillegg er det bevis på at noen insektmidler kan indusere atferdsunngåelse fra mygg48, og fôring med bakterier som potensielt induserer bivirkninger i dem, kan utløse lignende unngåelsesmønstre. I laboratoriets kontrollerte innstilling, hvor myggene ikke hadde en alternativ matkilde, hadde de ikke noe valg for å unngå sukkervannet med E. coli, og behovet for en næringsrik kilde ville sannsynligvis overstyre instinktet for å unngå bakteriene. Dette bør imidlertid vurderes dersom strategien skulle brukes i mindre kontrollerte omgivelser.
Det kan være mulig å målrette flere gener samtidig (ved hjelp av en konstruksjon, flere konstruksjoner eller en blanding av transformerte bakterieisolasjoner), men ytterligere studier er nødvendig for å vurdere effektiviteten. Et annet viktig hensyn til dette punktet er evalueringen av mulige off-target eller synergistiske effekter når du bruker enkelt eller flere mål. Etablering av hensiktsmessige kontrollgener og grupper er en viktig del av eksperimentell design. Videre er det fristende å spekulere i at denne tilnærmingen kan brukes til å målrette mot andre patogener eller virus49. Tidligere arbeid mot RNAi induksjon i mygg ble utført under forhold der reagenset ble direkte injisert, så E. coli var ikke til stede. E. coli kan gi et beskyttende rom som gir langsommere frigjøring av dsRNA over tid, noe som sikrer at eksponeringen er mer eller mindre kontinuerlig over en mye lengre periode29.
Til slutt viser disse resultatene at effektene av denne teknikken er justerbare ved å justere tidsrammen (lengde og startdag) for eksponering og mengden E. coli som brukes. Denne funksjonen tillot oss å studere funksjonene til essensielle gener (dsx og fkh) ved å identifisere optimale knockdown-forhold ved prøving og feiling. Dette øker sannsynligheten for at målgener av interesse kan undersøkes ved hjelp av denne teknikken.
Oppsummert ble det funnet at oral levering av RNAi til voksne mygg kan være enkel, allsidig og en kraftig tilnærming til å studere mygggenfunksjon og for å skape nye og formbare verktøy for vektorkontroll av myggbårne sykdommer.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker å takke de ansatte og forskerne innen Entomology Branch og Divisjon for parasittiske sykdommer og malaria ved CDC, og Brian Trigg og Michelle Chiu for hjelp med bakterieforberedelse ved JHU og/eller nyttige diskusjoner om dette arbeidet. Vi takker JHMRI Insectary og manager Chris Kizito for tilgang til, og oppdrett av, An. gambiae mygg. Vi takker Wei Huang (JHSPH) for hjelp til å skaffe plasmider PJet GFP og pPB47 GFP for bruk i denne studien. Støtten til dette arbeidet ble gitt av: NIH R21AI153588 (til DJA), et Johns Hopkins Malaria Research Institute Postdoctoral Fellowship (til MW); og ved et stipend fra Good Ventures Foundation og Open Philanthropy Project til CDC Foundation med tittelen Support cryopreservation and suppression of female development in mosquitoes to assist research for malaria, Open Philanthropy Project, 2017. Vi setter stor pris på hjelp fra JHU Microscope Facility ansatte og gjeldende NIH gi støtte til mikroskopet som brukes (NIH Grant #: S10OD016374). Funnene og konklusjonene i dette manuskriptet er forfatternes og representerer ikke nødvendigvis CDCs synspunkter. Bruk av varenavn er kun til identifikasjon og innebærer ikke godkjenning fra Centers for Disease Control and Prevention, Public Health Service eller US Department of Health and Human Services.
1 Kb Plus DNA Ladder | Thermo Fisher Scientific | 10787018 | |
2x Yeast Extract Tryptone (2xYT) Medium | BD Difco | DF0440-17 | |
AAPP | n/a | n/a | Antisera. 1:50 dilution (rabbit); gift from Fabrizio Lombardo |
AccuStart II PCR Supermix | Quantabio | 95137-100 | |
Agarose | Millipore Sigma | A9539 | |
Ampicillin | Millipore Sigma | A5354 | |
Anopheles gambiae G3 | BioDefense and Emerging Infections (BEI) Malaria Research and Reference Reagent Resource Center (MR4) | MRA-112 | |
BugDorm | BioQuip | 1452 | |
Centrifuge 5810R | Eppendorf | P022628181 | |
CrebA | DSHB | CrebA Rbt-PC | Antisera. 1:50 dilution (rabbit); generated by the Andrew Lab |
Damiens diet | BioServ | ||
DAPI | Life Technologies | n/a | 4′,6-diamidino-2-phenylindole; 1:200 dilution. |
Defibrinated sheep blood | HemoStat | DSB050 | |
Escherichia coli HT115 (DE3) | |||
Ethidium bromide | Millipore Sigma | E7637 | |
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | 4368814 | |
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside | Millipore Sigma | I5502 | |
JM109 Competent cells | Promega | L2005 | |
Luria Broth Media | Thermo Fisher Scientific | 10855001 | |
Mucin 2 | Proteintech | Muc2; 27 675-1-AP | Antisera. 1:100 dilution (mouse). |
Nanodrop 2000 | Thermo Fisher Scientific | ||
Nile Red | Sigma | n/a | Lipid dye; 1:50 dilution. |
Owl EasyCast B2 Mini Gel Horizontal Electrophoresis | Thermo Fisher Scientific | Model B2 | |
pGEMT easy | Promega | A3600 | |
Power SYBR-green PCR master MIX | Applied Biosystems | 4367659 | |
PureLink PCR purification kit | Thermo Fisher Scientific | K31001 | |
QuantaStudio 6 | Applied Biosystems | ||
QuantStudio6 Real Time PCR System | Applied Biosystems | ||
Rab11 | n/a | n/a | Antisera. 1:100 dilution (rabbit); generated by the Andrew Lab |
Rh-WGA | Vector Labs | n/a | Rhodamine-conjugated wheat germ agglutinin (chitin, O-GlcNAcylation dye); 1:40 dilution |
Sage | n/a | n/a | Antisera. 1:50 dilution (rat); generated by the Andrew Lab |
T4 DNA ligase | Promega | M1801 | |
Tetracycline | Millipore Sigma | 87128 | |
Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | |
Zeiss LSM700 fluorescence confocal microscope | Zeiss | ||
ANTIBODIES | |||
Chicken anti-Rat IgG (H+L), Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | A21472 | |
Goat anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | A28181 | |
IgG (H+L) Goat anti-Rabbit, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A27034 | |
Rabbit anti-Goat IgG (H+L), Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A27012 | |
PRIMERS | |||
ACT-2f: TACAACTCGATCATGAAGTGCGA | CDC Biotechnology Core Facility Branch | n/a | qRT-PCR primer |
ACT-3r: CCCGGGTACATGGTGGTACCGC CGGA |
CDC Biotechnology Core Facility Branch | n/a | qRT-PCR primer |
FKH_RNAi_F: GCCGACTTATGCTTAGCCCA | CDC Biotechnology Core Facility Branch | n/a | qRT-PCR primer |
FKH_RNAi_R: TAGCCGTCAATTCCTCCTGC | CDC Biotechnology Core Facility Branch | n/a | qRT-PCR primer |
newDSX-f: AGAGGGCGGGGAAATTCTAGT | CDC Biotechnology Core Facility Branch | n/a | qRT-PCR primer |
newDSX-r: GGGCTTGTGGCAGTACGAATA | CDC Biotechnology Core Facility Branch | n/a | qRT-PCR primer |
S7qf1: AGAACCAGCAGACCACCATC | CDC Biotechnology Core Facility Branch | n/a | qRT-PCR primer |
S7qr1: GCTGCAAACTTCGGCTATTC | CDC Biotechnology Core Facility Branch | n/a | qRT-PCR primer |