הערכה תפקודית של קינזין-7 CENP-E בזרעונים באמצעות עיכוב Vivo , אימונופלואורסנציה וציטומטריית זרימה
Summary
מאמר זה מדווח על עיכוב in vivo של CENP-E באמצעות ניתוח בטן והזרקת GSK923295 באשכים, מודל רב ערך לחלוקה מיוטית גברית. באמצעות בדיקות אימונופלואורסצנטיות, ציטומטריית זרימה ומיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת, אנו מראים כי עיכוב CENP-E גורם לחוסר תיאום כרומוזומים וחוסר יציבות גנומית בזרעונים של עכברים.
Abstract
באיקריוטים, מיוזה חיונית ליציבות הגנום ולמגוון גנטי ברבייה מינית. ניתוחים ניסיוניים של זרעונים באשכים הם קריטיים לחקירת הרכבת ציר והפרדת כרומוזומים בחלוקה מיוטית גברית. זרע העכבר הוא מודל אידיאלי למחקרים מכניסטיים של מיוזה, עם זאת, שיטות יעילות לניתוח של זרעונים חסרים. במאמר זה מדווחת שיטה מעשית ויעילה לעיכוב in vivo של קינזין-7 CENP-E בזרעונים של עכברים. מוצג הליך מפורט להזרקת אשכים של מעכב ספציפי GSK923295 באמצעות ניתוח בטן בעכברים בני 3 שבועות. יתר על כן, מתוארת כאן סדרה של פרוטוקולים לאיסוף וקיבוע רקמות, צביעת hematoxylin-eosin, immunofluorescence, ציטומטריית זרימה ומיקרוסקופ אלקטרונים הולכה. כאן אנו מציגים מודל עיכוב in vivo באמצעות ניתוח בטן והזרקת אשכים, שיכול להיות טכניקה רבת עוצמה לחקר מיוזה גברית. אנו גם מראים כי עיכוב CENP-E גורם לחוסר תיאום כרומוזומים ולמעצר מטאפאזי בזרעונים ראשוניים במהלך מיוזה I. שיטת העיכוב in vivo שלנו תאפשר מחקרים מכניסטיים של מיוזה, תשמש כשיטה שימושית לשינויים גנטיים של קווי נבט זכריים, ותשפוך אור על יישומים קליניים עתידיים.
Introduction
מיוזה היא אחד האירועים האבולוציוניים החשובים ביותר, הנוקשים ביותר, שהשתמרו אבולוציונית באורגניזמים אאוקריוטים, והיא חיונית לגמטוגנזה, רבייה מינית, שלמות הגנום ומגוון גנטי 1,2,3. ביונקים, תאי הנבט עוברים שתי חלוקות תאים עוקבות, מיוזה I ו-II, לאחר סבב אחד של שכפול DNA. שלא כמו כרומטידים אחים במיטוזה, כרומוזומים הומולוגיים משוכפלים מתחברים ונפרדים לשני תאי בת במהלך מיוזה I 4,5. במיוזה II, כרומטידים אחים מתפרקים ונפרדים ליצירת גמטות הפלואידים ללא שכפול DNA6. טעויות בכל אחת משתי החטיבות המיוטיות, כולל פגמים בהרכבת ציר והפרדת כרומוזומים, יכולות לגרום לאובדן גמטות, סטריליות או תסמונות אנופלואידיות 7,8,9.
מחקרים מצטברים הראו כי מנועים ממשפחת הקינזינים ממלאים תפקיד מכריע בוויסות יישור הכרומוזומים והפרדתם, הרכבת צירים, ציטוקינזיס והתקדמות מחזור התא בתאים מיטוטיים ומיאוטיים 10,11,12. Kinesin-7 CENP-E (חלבון Centromere E) הוא מנוע קינטוחור מכוון פלוס הנדרש לקונגרס כרומוזומים, הובלה ויישור כרומוזומים, וויסות מחסום הרכבת ציר במיטוזה 13,14,15,16,17,18. במהלך מיוזה, עיכוב CENP-E על ידי המעכב הספציפי GSK923295 מוביל למעצר מחזור התא, חוסר תיאום כרומוזומים, חוסר ארגון ציר, וחוסר יציבות גנום בתאים ספרמטוגניים19. דפוסי הלוקליזציה והדינמיקה של CENP-E בצנטרומרים של זרעונים מתחלקים מצביעים על כך ש-CENP-E מקיים אינטראקציה עם חלבוני קינטוחור לצורך הרכבה רציפה של צנטרומרים במהלך מיוזה I20,21. בביציות, CENP-E נדרש ליישור כרומוזומים ולהשלמת מיוזה I13,22,23. נוגדנים או הזרקת מורפולינו של CENP-E גורמים לכרומוזומים לא מיושרים, אוריינטציה לא תקינה של קינטוחור ומיוזה שאני עוצר הן בביציות עכבר והן בביציות דרוזופילה 23. בהשוואה לתפקידים החיוניים של CENP-E במיטוזה, הפונקציות והמנגנונים של CENP-E במיוזה נותרו בלתי ידועים במידה רבה. מנגנונים מפורטים של CENP-E בקונגרס הכרומוזומים ויציבות הגנום בתאים מיוטיים זכריים עדיין לא ברורים.
ספרמטוגנזה היא תהליך פיזיולוגי מורכב וארוך טווח, הכולל שגשוג זרעונים רציף, מיוזה וספרמיוגנזה. לכן, התהליך כולו קשה במיוחד להתרבות במבחנה ביונקים ובמינים אחרים24,25. אי אפשר לגרום להתמיינות זרעונים לאחר שלב הפצ’יטן במבחנה. מחקרים על חלוקות מיוטיות גבריות הוגבלו בדרך כלל לניתוחים ניסיוניים של שלב מיוטי מוקדם25,26. למרות מאמצים טכנולוגיים רבים, כולל תרבית קצרת טווח של זרעונים27,28 ושיטות תרבית איברים 25, יש מעט שיטות יעילות לחקר חלוקה מיוטית גברית. יתר על כן, מחיקה גנטית של גנים חיוניים גורמת בדרך כלל למעצר התפתחותי ולקטלניות עוברית. לדוגמה, עוברי עכברים חסרי CENP-E אינם מצליחים להשתיל ואינם יכולים לפתח מעבר להשתלה29, דבר המהווה מכשול במחקרים מכניסטיים של CENP-E במיוזה. יחד, הקמת מערכת מעשית וישימה לחקר החלוקה המיוטית הגברית יכולה לקדם מאוד את תחום המחקר של מיוזה.
המעכב הקטן החדיר לתאים הוא כלי רב עוצמה לחקר מנועי קינזין בחלוקת תאים ובתהליכי התפתחות. המעכב האלוסטרי, GSK923295, נקשר באופן ספציפי לתחום המוטורי CENP-E, חוסם את שחרור ADP (אדנוזין דיפוספט), ולבסוף מייצב את האינטראקציות בין CENP-E ומיקרוטובולים30. במחקר זה, מודל עכבר מעכב in vivo מוצג באמצעות ניתוח בטן והזרקת אשכים של GSK923295. עיכוב CENP-E גורם לחוסר התאמה של כרומוזומים במטא-פאזה I של זרעונים ראשוניים. יתר על כן, עיכוב CENP-E מוביל למעצר מיוטי של זרעונים ולהפרעה של זרעונים. סדרה של פרוטוקולים מתוארת לניתוח של זרעונים וניתן ליישם אותם כדי לצפות במיקרוטובולים של ציר מיוטי, כרומוזומים הומולוגיים ואברונים תת-תאיים בזרעונים. שיטת העיכוב in vivo שלנו היא שיטה יעילה לחקר חלוקה מיוטית וספרמטוגנזה.
Protocol
Representative Results
Discussion
במחקר זה, ביססנו מודל עיכוב CENP-E in vivo של אשכי עכבר באמצעות ניתוח בטן ומיקרו-הזרקה של GSK923295. לניתוח הבטן ולשיטת הזרקת האשכים המשמשים במחקר זה יש את היתרונות הבאים. ראשית, הוא אינו מוגבל לגיל העכברים. נסיינים יכולים לבצע הזרקת אשכים בשלב מוקדם, למשל, בעכברים בני 3 שבועות או צעירים יותר. שנית…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לכל חברי מעבדת Cytoskeleton באוניברסיטה הרפואית פוג’יאן על דיונים מועילים. אנו מודים לג’ון-ג’ין לין במרכז השירות לטכנולוגיה ציבורית, האוניברסיטה הרפואית פוג’יאן על הסיוע הטכני בציטומטריית זרימה. אנו מודים למינג-שיה וו וללין-יינג ג’ואו במעבדת מיקרוסקופיית אלקטרונים במרכז השירות לטכנולוגיה ציבורית, האוניברסיטה הרפואית פוג’יאן על הסיוע הטכני במיקרוסקופ אלקטרונים. אנו מודים לסי-יי ג’נג, יינג לין, צ’י קה וג’ון סונג במרכז להוראה ניסויית של מדעי הרפואה הבסיסיים באוניברסיטה הרפואית פוג’יאן על תמיכתם. מחקר זה נתמך על ידי המענקים הבאים: הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מענק מספר 82001608), הקרן למדעי הטבע של מחוז פוג’יאן, סין (מענק מספר 2019J05071), פרויקט טכנולוגיית הבריאות המחוזית פוג’יאן (מענק מספר 2018-1-69), קרן סטארט-אפ למחקר מדעי, האוניברסיטה הרפואית פוג’יאן (מספר מענק 2017XQ1001), פרויקט מימון סטארט-אפ של כישרונות ברמה גבוהה של האוניברסיטה הרפואית פוג’יאן (מספר מענק XRCZX2017025) ופרויקט מחקר של חינוך מקוון והוראה של סטודנטים לתואר שני ברפואה סינית (מענק מספר B-YXC20200202-06).
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
| 1 ml Syringe | Several commercial brands available | Sterile. | |
| 1.5 mL Centrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | |
| 50 mL Centrifuge Tube | Corning | 430828 | |
| 6 cm Petri dish | Corning | 430166 | |
| 95% Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10009164 | |
| tubulin rabbit polyclonal antibody | Beyotime | AF0001 | For immunofluorescence assays. Use at 1:100. |
| rabbit anti-Histone H3 (phospho S10) monoclonal antibody | Abcam | ab267372 | For immunofluorescence assays. Use at 1:100. |
| rabbit anti-TUBA4A polyclonal antibody | Sangon Biotech | D110022 | For immunofluorescence assays. Use at 1:100. |
| Anti-SYCP3 rabbit monoclonal antibody | Abcam | ab175191 | For immunofluorescence assays. Use at 1:100. |
| Adhesion microscope slides | CITOTEST | 188105 | |
| Alexa fluor 488-labeled goat anti-rabbit antibody | Beyotime | A0423 | Sencodary antibody. Use at 1:500. |
| Aluminium potassium sulphate | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10001060 | |
| Anhydrous ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 100092690 | |
| Anti-fade mounting medium | Beyotime | P0131 | Prevent photobleching of flourescent signals. |
| BD FACS Canto II | BD Biosciences | FACS Canto II | |
| Bovine Serum Albumin | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 69003435 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424BK745380 | |
| Chloral hydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 80037516 | |
| Citric acid | Shanghai Experiment Reagent Co., Ltd | 122670 | |
| Collagenase | Sangon Biotech | A004194-0100 | |
| Coverslips | CITOTEST | 10212020C | 20 × 20 mm. Thickness 0.13-0.16 mm. |
| DAPI | Beyotime | C1006 | |
| Dye vat | Several commercial brands available | 91347802 | |
| Eosin Y, alcohol soluble | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 71014460 | |
| Ether | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10009318 | |
| Formaldehyde – aqueous solution | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10010018 | |
| GSK923295 | MedChemExpress | HY-10299 | |
| Hematoxylin, anhydrous | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 71020784 | |
| ICR mouse | Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd | ||
| Image J software | National Institutes of Health | https://imagej.nih.gov/ij/ | Fluorescent image analysis. |
| Leica ultramicrotome | Leica | ||
| Leica EM UC-7 ultramicrotome | Leica | EM UC7 | |
| Modfit MFLT32 | Verity Software House | For analysis of flow cytometry results. | |
| Nail polish | Several commercial brands available | ||
| Neutral gum | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10004160 | |
| Nikon Ti-S2 microscope | Nikon | Ti-S2 | |
| Picric acid | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | J60807 | |
| Rheodyne | Sangon Biotech | F519160-0001 | 10 μl rheodyne |
| Sliced paraffin | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 69019461 | |
| Sodium iodate | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 80117214 | |
| Surgical instruments | Several commercial brands available | For abdominal surgery. Sterilize at 121 °C, 20 min. | |
| Transmission electron microscope | FEI | Tecnai G2 | |
| Trisodium citrate dihydrate | Shanghai Experiment Reagent Co., Ltd | 173970 | |
| Triton X-100 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 30188928 | Dilute in sterile PBS to make a 0.25% working solution. |
| Tween 20 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 30189328 | Dilute in sterile PBS to make a 0.1% working solution. |
| Paraformaldehyde | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 80096618 | |
| Xylene | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10023418 |
Riferimenti
- Lenormand, T., Engelstädter, J., Johnston, S. E., Wijnker, E., Haag, C. R. Evolutionary mysteries in meiosis. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 371 (1706), 20160001 (2016).
- Brandeis, M. New-age ideas about age-old sex: separating meiosis from mating could solve a century-old conundrum. Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society. 93 (2), 801-810 (2018).
- Lane, S., Kauppi, L. Meiotic spindle assembly checkpoint and aneuploidy in males versus females. Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 76 (6), 1135-1150 (2019).
- Handel, M. A., Schimenti, J. C. Genetics of mammalian meiosis: regulation, dynamics and impact on fertility. Nature Reviews Genetics. 11 (2), 124-136 (2010).
- Miller, M. P., Amon, A., Ünal, E. Meiosis I: when chromosomes undergo extreme makeover. Current Opinion in Cell Biology. 25 (6), 687-696 (2013).
- Duro, E., Marston, A. L. From equator to pole: splitting chromosomes in mitosis and meiosis. Genes & Development. 29 (2), 109-122 (2015).
- Eaker, S., Pyle, A., Cobb, J., Handel, M. A. Evidence for meiotic spindle checkpoint from analysis of spermatocytes from Robertsonian-chromosome heterozygous mice. Journal of Cell Science. 114, 2953-2965 (2001).
- Faisal, I., Kauppi, L. Reduced MAD2 levels dampen the apoptotic response to non-exchange sex chromosomes and lead to sperm aneuploidy. Development. 144 (11), 1988-1996 (2017).
- Bolcun-Filas, E., Handel, M. A. Meiosis: the chromosomal foundation of reproduction. Biology of Reproduction. 99 (1), 112-126 (2018).
- Lawrence, C. J., et al. A standardized kinesin nomenclature. The Journal of Cell Biology. 167 (1), 19-22 (2004).
- Cross, R. A., McAinsh, A. Prime movers: the mechanochemistry of mitotic kinesins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (4), 257-271 (2014).
- Camlin, N. J., McLaughlin, E. A., Holt, J. E. Motoring through: the role of kinesin superfamily proteins in female meiosis. Human Reproduction Update. 23 (4), 409-420 (2017).
- Yen, T. J., Li, G., Schaar, B. T., Szilak, I., Cleveland, D. W. CENP-E is a putative kinetochore motor that accumulates just before mitosis. Nature. 359 (6395), 536-539 (1992).
- Wood, K. W., Sakowicz, R., Goldstein, L. S., Cleveland, D. W. CENP-E is a plus end-directed kinetochore motor required for metaphase chromosome alignment. Cell. 91 (3), 357-366 (1997).
- Abrieu, A., Kahana, J. A., Wood, K. W., Cleveland, D. W. CENP-E as an essential component of the mitotic checkpoint in vitro. Cell. 102 (6), 817-826 (2000).
- Mao, Y., Desai, A., Cleveland, D. W. Microtubule capture by CENP-E silences BubR1-dependent mitotic checkpoint signaling. The Journal of Cell Biology. 170 (6), 873-880 (2005).
- Gudimchuk, N., et al. Kinetochore kinesin CENP-E is a processive bi-directional tracker of dynamic microtubule tips. Nature Cell Biology. 15 (9), 1079-1088 (2013).
- Yu, K. W., Zhong, N., Xiao, Y., She, Z. Y. Mechanisms of kinesin-7 CENP-E in kinetochore-microtubule capture and chromosome alignment during cell division. Biology of the Cell. 111 (6), 143-160 (2019).
- She, Z. Y., et al. Kinesin-7 CENP-E regulates chromosome alignment and genome stability of spermatogenic cells. Cell Death Discovery. 6, 25 (2020).
- Parra, M. T., et al. Sequential assembly of centromeric proteins in male mouse meiosis. PLoS Genetics. 5 (3), 1000417 (2009).
- Parra, M. T., et al. Expression and behaviour of CENP-E at kinetochores during mouse spermatogenesis. Chromosoma. 111 (1), 53-61 (2002).
- Duesbery, N. S., et al. CENP-E is an essential kinetochore motor in maturing oocytes and is masked during mos-dependent, cell cycle arrest at metaphase II. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (17), 9165-9170 (1997).
- Gui, L., Homer, H. Spindle assembly checkpoint signalling is uncoupled from chromosomal position in mouse oocytes. Development. 139 (11), 1941-1946 (2012).
- Parks, J. E., Lee, D. R., Huang, S., Kaproth, M. T. Prospects for spermatogenesis in vitro. Theriogenology. 59 (1), 73-86 (2003).
- Sato, T., et al. In vitro production of functional sperm in cultured neonatal mouse testes. Nature. 471 (7339), 504-507 (2011).
- Staub, C. A century of research on mammalian male germ cell meiotic differentiation in vitro. Journal of Andrology. 22 (6), 911-926 (2001).
- Handel, M. A., Caldwell, K. A., Wiltshire, T. Culture of pachytene spermatocytes for analysis of meiosis. Developmental Genetics. 16 (2), 128-139 (1995).
- La Salle, S., Sun, F., Handel, M. A. Isolation and short-term culture of mouse spermatocytes for analysis of meiosis. Methods in Molecular Biology. 558, 279-297 (2009).
- Putkey, F. R., et al. Unstable kinetochore-microtubule capture and chromosomal instability following deletion of CENP-E. Developmental Cell. 3 (3), 351-365 (2002).
- Wood, K. W., et al. Antitumor activity of an allosteric inhibitor of centromere-associated protein-E. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (13), 5839-5844 (2010).
- Nam, D., Sershon, R. A., Levine, B. R., Della Valle, C. J. The use of closed incision negative-pressure wound therapy in orthopaedic surgery. Journal of the American Academy Orthopaedic Surgeons. 26 (9), 295-302 (2018).
- She, Z. Y., et al. Kinesin-5 Eg5 is essential for spindle assembly and chromosome alignment of mouse spermatocytes. Cell Division. 15, 6 (2020).
- She, Z. Y., et al. Kinesin-6 family motor KIF20A regulates central spindle assembly and acrosome biogenesis in mouse spermatogenesis. Biochimica et Biophysica Acta-Molecular Cell Research. 1867 (4), 118636 (2020).
- Wellard, S. R., Hopkins, J., Jordan, P. W. A seminiferous tubule squash technique for the cytological analysis of spermatogenesis using the mouse model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56453 (2018).
- Sato, M., Ishikawa, A., Kimura, M. Direct injection of foreign DNA into mouse testis as a possible in vivo gene transfer system via epididymal spermatozoa. Molecular Reproduction and Development. 61 (1), 49-56 (2002).
- Coward, K., et al. Expression of a fluorescent recombinant form of sperm protein phospholipase C zeta in mouse epididymal sperm by in vivo gene transfer into the testis. Fertility and Sterility. 85, 1281-1289 (2006).
- Davis, S., et al. Potent inhibition of microRNA in vivo without degradation. Nucleic Acids Research. 37 (1), 70-77 (2009).
- Zhao, H. T., et al. LRRK2 antisense oligonucleotides ameliorate α-Synuclein inclusion formation in a Parkinson’s Disease mouse model. Molecular Therapy-Nucleic Acids. 8, 508-519 (2017).
- Shahzad, K., et al. CHOP-ASO Ameliorates Glomerular and Tubular Damage on Top of ACE Inhibition in Diabetic Kidney Disease. Journal of the American Society of Nephrology. 3, 2021040431 (2021).
- Kang, K., Niu, B., Wu, C., Hua, J., Wu, J. The construction and application of lentiviral overexpression vector of goat miR-204 in testis. Research in Veterinary Science. 130, 52-58 (2020).
- Karabasheva, D., Smyth, J. T. Preparation of Drosophila larval and pupal testes for analysis of cell division in live, intact tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60961 (2020).
- Wiltshire, T., Park, C., Caldwell, K. A., Handel, M. A. Induced premature G2/M-phase transition in pachytene spermatocytes includes events unique to meiosis. Biologia dello sviluppo. 169 (2), 557-567 (1995).
- Cobb, J., Cargile, B., Handel, M. A. Acquisition of competence to condense metaphase I chromosomes during spermatogenesis. Biologia dello sviluppo. 205 (1), 49-64 (1999).
- Cobb, J., Reddy, R. K., Park, C., Handel, M. A. Analysis of expression and function of topoisomerase I and II during meiosis in male mice. Molecular Reproduction and Development. 46 (4), 489-498 (1997).
- Inselman, A., Handel, M. A. Mitogen-activated protein kinase dynamics during the meiotic G2/MI transition of mouse spermatocytes. Biology of Reproduction. 71 (2), 570-578 (2004).
- Muramatsu, T., Shibata, O., Ryoki, S., Ohmori, Y., Okumura, J. Foreign gene expression in the mouse testis by localized in vivo gene transfer. Biochemical and Biophysical Research Communications. 233 (1), 45-49 (1997).
- Yamazaki, Y., et al. In vivo gene transfer to mouse spermatogenic cells by deoxyribonucleic acid injection into seminiferous tubules and subsequent electroporation. Biology of Reproduction. 59 (6), 1439-1444 (1998).
- Yamazaki, Y., Yagi, T., Ozaki, T., Imoto, K. In vivo gene transfer to mouse spermatogenic cells using green fluorescent protein as a marker. The Journal of Experimental Zoology. 286 (2), 212-218 (2000).
- Coward, K., Kubota, H., Parrington, J. In vivo gene transfer into testis and sperm: developments and future application. Archives of Andrology. 53 (4), 187-197 (2007).
