Valutazione funzionale della kinesina-7 CENP-E negli spermatociti mediante inibizione in vivo , immunofluorescenza e citometria a flusso

Sommario

Questo articolo riporta un'inibizione in vivo di CENP-E attraverso la chirurgia addominale e l'iniezione testicolare di GSK923295, un valido modello per la divisione meiotica maschile. Utilizzando i saggi di immunofluorescenza, citometria a flusso e microscopia elettronica a trasmissione, dimostriamo che l'inibizione di CENP-E provoca disallineamento cromosomico e instabilità del genoma negli spermatociti di topo.

Abstract

Negli eucarioti, la meiosi è essenziale per la stabilità del genoma e la diversità genetica nella riproduzione sessuale. Le analisi sperimentali degli spermatociti nei testicoli sono fondamentali per le indagini sull'assemblaggio del fuso e sulla segregazione cromosomica nella divisione meiotica maschile. Lo spermatocita di topo è un modello ideale per gli studi meccanicistici della meiosi, tuttavia mancano metodi efficaci per l'analisi degli spermatociti. In questo articolo, viene riportato un metodo pratico ed efficiente per l'inibizione in vivo della kinesina-7 CENP-E negli spermatociti di topo. Viene presentata una procedura dettagliata per l'iniezione testicolare di un inibitore specifico GSK923295 attraverso la chirurgia addominale in topi di 3 settimane. Inoltre, qui descritti una serie di protocolli per la raccolta e la fissazione dei tessuti, la colorazione dell'ematossina-eosina, l'immunofluorescenza, la citometria a flusso e la microscopia elettronica a trasmissione. Qui presentiamo un modello di inibizione in vivo tramite chirurgia addominale e iniezione testicolare, che potrebbe essere una tecnica potente per studiare la meiosi maschile. Dimostriamo anche che l'inibizione di CENP-E provoca disallineamento cromosomico e arresto della metafase negli spermatociti primari durante la meiosi I. Il nostro metodo di inibizione in vivo faciliterà gli studi meccanicistici della meiosi, servirà come metodo utile per le modificazioni genetiche delle linee germinali maschili e farà luce sulle future applicazioni cliniche.

Introduzione

La meiosi è uno degli eventi evolutivi evolutivi più importanti, altamente rigidi negli organismi eucariotici, ed è essenziale per la gametogenesi, la riproduzione sessuale, l'integrità del genoma e la diversità genetica ^1,2,3. Nei mammiferi, le cellule germinali subiscono due divisioni cellulari successive, meiosi I e II, dopo un singolo ciclo di replicazione del DNA. A differenza dei cromatidi fratelli nella mitosi, i cromosomi omologhi duplicati si accoppiano e si segregano in due cellule figlie durante la meiosi I ^4,5

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati esaminati e approvati dal Comitato per la cura e l'uso degli animali presso la Fujian Medical University (numero di protocollo SYXK 2016-0007). Tutti gli esperimenti sui topi sono stati eseguiti in conformità con le linee guida pertinenti della cura e dell'uso degli animali da laboratorio del National Institutes of Health (numero di pubblicazioni NIH 8023, riviste nel 1978).

1. Costruzione di modelli murini di inibizione CENP-E mediati da GSK923295

1. Sterilizzare gli strumenti chirurgici a 121 °C per 30 minuti. Irradiare il banco di lavoro chirurgico ultra-pulito con ul....

Risultati

Abbiamo costruito con successo un modello di inibizione CENP-E in vivo di testicoli murini attraverso chirurgia addominale e iniezione testicolare di GSK923295¹⁹. I passaggi tecnici chiave di questo metodo sono stati illustrati nella Figura 1. Dopo l'iniezione testicolare di GSK923295 per 4 giorni, i testicoli sono stati raccolti per ulteriori analisi. Nel gruppo di controllo, l'onda spermatogena nei tubuli seminiferi era regolare e organizzata (

Discussione

In questo studio, abbiamo stabilito un modello di inibizione CENP-E in vivo dei testicoli di topo utilizzando la chirurgia addominale e la microiniezione di GSK923295. La chirurgia addominale e il metodo di iniezione testicolare utilizzati in questo studio presentano i seguenti vantaggi. Innanzitutto, non è limitato all'età dei topi. Gli sperimentatori possono eseguire l'iniezione testicolare in una fase precoce, ad esempio su topi di 3 settimane o più giovani. In secondo luogo, GSK923295 ha un effetto inibitori.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
0,25% Tripsina-EDTA	Gibco	25200056
1 ml Siringa	Diverse marche commerciali disponibili		Sterile.
Provetta da centrifuga da 1,5 mL	Axygen	MCT-150-C
Provetta da centrifuga da 50 mL	Corning	430828
Piastra di Petri da 6 cm	Corning	430166
95% Ethanol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10009164
tubulina anticorpo policlonale di coniglio	Beyotime	AF0001	Per saggi di immunofluorescenza. Utilizzare a 1:100.
anticorpo monoclonale anti-istonico H3 (fosfo S10) di coniglio	Abcam	ab267372	Per saggi di immunofluorescenza. Utilizzare a 1:100.
coniglio anticorpo policlonale anti-TUBA4A	Sangon Biotech	D110022	Per saggi di immunofluorescenza. Utilizzare a 1:100.
Anticorpo monoclonale di coniglio anti-SYCP3	Abcam	ab175191	Per saggi di immunofluorescenza. Utilizzare a 1:100.
Vetrini per microscopio ad adesione	CITOTEST	188105
Alexa fluor 488-marcato con anticorpo di capra anti-coniglio	Beyotime	A0423	Anticorpo Sencodary. Utilizzare a 1:500.
Solfato di alluminio e potassio	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10001060
Etanolo anidro	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	100092690
Mezzo di montaggio anti-sbiadimento	Beyotime	P0131	Prevenire il fotobleching dei segnali fluorescenti.
BD FACS Canto II	BD Biosciences	FACS Canto II
Albumina sierica bovina	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	69003435
Centrifuga	Eppendorf	5424BK745380
Cloralio idrato	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	80037516
Acido citrico	Shanghai Experiment Reagent Co., Ltd	122670
Collagenasi	Sangon Biotech	A004194-0100
Vetrini coprioggetti	CITOTEST	10212020C	20 &volte; 20 mm. Spessore 0,13-0,16 mm.
DAPI	Beyotime	C1006
Vasca colorante	Diverse marche commerciali disponibili	91347802
Eosina Y, solubile in alcool	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	71014460
Ether	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10009318
Formaldeide - soluzione acquosa	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10010018
GSK923295	MedChemExpress	HY-10299
Ematossilina, anidro	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	71020784
ICR mouse	Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd
Image J software	National Institutes of Health	https://imagej.nih.gov/ij/	Analisi delle immagini fluorescenti.
Ultramicrotomo Leica
Leica EM UC-7 ultramicrotomo	Leica	EM UC7
Modfit MFLT32	Verity Software House		Per l'analisi dei risultati della citometria a flusso.
Smalto per unghie	Diverse marche commerciali disponibili
Gomma neutra	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10004160
Nikon Ti-S2 microscopio	Nikon	Ti-S2
Acido picrico	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	J60807
Rheodyne	Sangon Biotech	F519160-0001	10 μ l rheodyne
Paraffina affettata	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	69019461
Iodato di sodio	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	80117214
Strumenti chirurgici	Diverse marche commerciali disponibili		per la chirurgia addominale. Sterilizzare a 121 gradi C, 20 min.
Microscopio elettronico a trasmissione	FEI	Tecnai G2
Citrato trisodico diidrato	Shanghai Experiment Reagent Co., Ltd	173970
Triton X-100	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	30188928	Diluire in PBS sterile per ottenere una soluzione di lavoro allo 0,25%.
Tween 20	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	30189328	Diluire in PBS sterile per ottenere una soluzione di lavoro allo 0,1%.
Paraformaldeide	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	80096618
Xylene	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10023418