Dit artikel meldt een in vivo remming van CENP-E door middel van abdominale chirurgie en testiculaire injectie van GSK923295, een waardevol model voor mannelijke meiotische deling. Met behulp van de immunofluorescentie, flowcytometrie en transmissie-elektronenmicroscopietests tonen we aan dat CENP-E-remming resulteert in chromosoomafwijking en genoominstabiliteit in spermatocyten van muizen.
Bij eukaryoten is meiose essentieel voor genoomstabiliteit en genetische diversiteit in seksuele voortplanting. Experimentele analyses van spermatocyten in teelballen zijn van cruciaal belang voor het onderzoek naar spindelassemblage en chromosoomsegregatie bij mannelijke meiotische deling. De spermatocyt van de muis is een ideaal model voor mechanistische studies van meiose, maar de effectieve methoden voor de analyse van spermatocyten ontbreken. In dit artikel wordt een praktische en efficiënte methode beschreven voor de in vivo remming van kinesine-7 CENP-E in spermatocyten van muizen. Een gedetailleerde procedure voor testiculaire injectie van een specifieke remmer GSK923295 door middel van abdominale chirurgie bij 3 weken oude muizen wordt gepresenteerd. Verder wordt hier een reeks protocollen beschreven voor weefselverzameling en -fixatie, hematoxyline-eosinekleuring, immunofluorescentie, flowcytometrie en transmissie-elektronenmicroscopie. Hier presenteren we een in vivo remmingsmodel via buikchirurgie en testiculaire injectie, dat een krachtige techniek zou kunnen zijn om mannelijke meiose te bestuderen. We tonen ook aan dat CENP-E-remming resulteert in chromosoomafwijking en metafasestilstand in primaire spermatocyten tijdens meiose I. Onze in vivo remmingsmethode zal mechanistische studies van meiose vergemakkelijken, dienen als een nuttige methode voor genetische modificaties van mannelijke kiembanen en een licht werpen op toekomstige klinische toepassingen.
Meiose is een van de belangrijkste, zeer rigide, evolutionair geconserveerde gebeurtenissen in eukaryote organismen en is essentieel voor gametogenese, seksuele voortplanting, genoomintegriteit en genetische diversiteit 1,2,3. Bij zoogdieren ondergaan de geslachtscellen twee opeenvolgende celdelingen, meiose I en II, na een enkele ronde DNA-replicatie. In tegenstelling tot zusterchromatiden bij mitose, paren gedupliceerde homologe chromosomen en scheiden zich in twee dochtercellen tijdens meiose I 4,5. Bij meiose II trekken zusterchromatiden uit elkaar en scheiden zich om haploïde gameten te vormen zonder DNA-replicatie6. Fouten in een van de twee meiotische delingen, waaronder spindelassemblagedefecten en chromosoommissegregatie, kunnen leiden tot het verlies van gameten, steriliteit of aneuploïdiesyndromen 7,8,9.
Accumulerende studies hebben aangetoond dat kinesine-familiemotoren een cruciale rol spelen bij de regulatie van chromosoomuitlijning en -segregatie, spindelassemblage, cytokinese en celcyclusprogressie in zowel mitotische als meiotische cellen10,11,12. Kinesine-7 CENP-E (Centromeer eiwit E) is een plus-end-gerichte kinetochoormotor die nodig is voor chromosoomcongres, chromosoomtransport en -uitlijning, en de regulatie van spindelassemblagecontrolepunt in mitose 13,14,15,16,17,18. Tijdens meiose leidt CENP-E-remming door de specifieke remmer GSK923295 tot celcyclusstilstand, chromosoomafwijking, spindeldesorganisatie en genoominstabiliteit in spermatogene cellen19. De lokalisatiepatronen en dynamiek van CENP-E bij de centromeren van delende spermatocyten geven aan dat CENP-E interageert met kinetochooreiwitten voor de sequentiële assemblage van centromeren tijdens meiose I20,21. In eicellen is CENP-E vereist voor chromosoomuitlijning en de voltooiing van meiose I13,22,23. Antilichamen of morfolino-injectie van CENP-E resulteert in verkeerd uitgelijnde chromosomen, abnormale kinetochoororiëntatie en meiose die ik arresteer in zowel muis- als Drosophila-eicellen 23. Vergeleken met de essentiële rollen van CENP-E bij mitose, blijven de functies en mechanismen van CENP-E in meiose grotendeels onbekend. Gedetailleerde mechanismen van CENP-E in chromosoomcongres en genoomstabiliteit in mannelijke meiotische cellen moeten nog worden opgehelderd.
Spermatogenese is een complex en langdurig fysiologieproces, waarbij sequentiële spermatogoniaproliferatie, meiose en spermiogenese betrokken zijn. Daarom is het hele proces buitengewoon moeilijk om in vitro te worden gereproduceerd bij zoogdieren en andere soorten24,25. Het is onmogelijk om spermatocytendifferentiatie te induceren na het pachyteenstadium in vitro. Studies naar mannelijke meiotische delingen zijn over het algemeen beperkt gebleven tot experimentele analyses van vroege meiotische profase25,26. Ondanks vele technologische inspanningen, waaronder kortetermijncultuur van spermatocyten27,28 en orgaankweekmethoden25, zijn er weinig effectieve methoden om mannelijke meiotische deling te bestuderen. Bovendien resulteert genetische deletie van essentiële genen meestal in ontwikkelingsstilstand en embryonale letaliteit. Muizenembryo’s zonder CENP-E kunnen bijvoorbeeld niet implanteren en kunnen zich niet ontwikkelen na implantatie29, wat een obstakel is in mechanistische studies van CENP-E in meiose. Alles bij elkaar genomen kan het opzetten van een praktisch en haalbaar systeem om mannelijke meiotische deling te bestuderen het onderzoeksveld van meiose aanzienlijk bevorderen.
De kleincellige remmer is een krachtig hulpmiddel om kinesinemotoren in celdeling en ontwikkelingsprocessen te bestuderen. De allosterische remmer, GSK923295, bindt specifiek aan het CENP-E-motordomein, blokkeert de afgifte van ADP (adenosinedifosfaat) en stabiliseert uiteindelijk de interacties tussen CENP-E en microtubuli30. In deze studie wordt een in vivo remmingsmuismodel gepresenteerd door middel van abdominale chirurgie en testiculaire injectie van GSK923295. CENP-E-remming resulteert in chromosoomafwijking in metafase I van primaire spermatocyten. Bovendien leidt CENP-E-remming tot meiotische arrestatie van spermatocyten en de verstoring van spermatogenese. Een reeks protocollen wordt beschreven voor de analyse van spermatocyten en kan worden toegepast om meiotische spindelmicrotubuli, homologe chromosomen en subcellulaire organellen in spermatocyten te observeren. Onze in vivo remmingsmethode is een effectieve methode voor het bestuderen van meiotische deling en spermatogenese.
In deze studie hebben we een in vivo CENP-E-remmingsmodel van muistestikels opgesteld met behulp van de buikchirurgie en micro-injectie van GSK923295. De abdominale chirurgie en testiculaire injectiemethode die in dit onderzoek wordt gebruikt, heeft de volgende voordelen. Ten eerste is het niet beperkt tot de leeftijd van muizen. Experimentatoren kunnen testiculaire injectie in een vroeg stadium uitvoeren, bijvoorbeeld bij muizen van 3 weken oud of jonger. Ten tweede heeft GSK923295 een specifiek en uitstekend r…
The authors have nothing to disclose.
We bedanken alle leden van het Cytoskeleton Laboratory aan de Fujian Medical University voor nuttige discussies. We bedanken Jun-Jin Lin van het Public Technology Service Center, Fujian Medical University voor technische assistentie bij flowcytometrie. We bedanken Ming-Xia Wu en Lin-Ying Zhou bij Electron Microscopy Lab van Public Technology Service Center, Fujian Medical University voor technische assistentie bij elektronenmicroscopie. We bedanken Si-Yi Zheng, Ying Lin, Qi Ke en Jun Song van het Experimental Teaching Center of Basic Medical Sciences aan de Fujian Medical University voor hun steun. Deze studie werd ondersteund door de volgende beurzen: National Natural Science Foundation of China (subsidienummer 82001608), Natural Science Foundation of Fujian Province, China (subsidienummer 2019J05071), Fujian Provincial Health Technology Project (subsidienummer 2018-1-69), Startup Fund for Scientific Research, Fujian Medical University (subsidienummer 2017XQ1001), Fujian Medical University high level talents scientific research start-up funding project (subsidienummer XRCZX2017025) en Onderzoeksproject van online onderwijs en onderwijs van afgestudeerde studenten Chinese geneeskunde (beursnummer B-YXC20200202-06).
0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
1 ml Syringe | Several commercial brands available | Sterile. | |
1.5 mL Centrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | |
50 mL Centrifuge Tube | Corning | 430828 | |
6 cm Petri dish | Corning | 430166 | |
95% Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10009164 | |
tubulin rabbit polyclonal antibody | Beyotime | AF0001 | For immunofluorescence assays. Use at 1:100. |
rabbit anti-Histone H3 (phospho S10) monoclonal antibody | Abcam | ab267372 | For immunofluorescence assays. Use at 1:100. |
rabbit anti-TUBA4A polyclonal antibody | Sangon Biotech | D110022 | For immunofluorescence assays. Use at 1:100. |
Anti-SYCP3 rabbit monoclonal antibody | Abcam | ab175191 | For immunofluorescence assays. Use at 1:100. |
Adhesion microscope slides | CITOTEST | 188105 | |
Alexa fluor 488-labeled goat anti-rabbit antibody | Beyotime | A0423 | Sencodary antibody. Use at 1:500. |
Aluminium potassium sulphate | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10001060 | |
Anhydrous ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 100092690 | |
Anti-fade mounting medium | Beyotime | P0131 | Prevent photobleching of flourescent signals. |
BD FACS Canto II | BD Biosciences | FACS Canto II | |
Bovine Serum Albumin | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 69003435 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5424BK745380 | |
Chloral hydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 80037516 | |
Citric acid | Shanghai Experiment Reagent Co., Ltd | 122670 | |
Collagenase | Sangon Biotech | A004194-0100 | |
Coverslips | CITOTEST | 10212020C | 20 × 20 mm. Thickness 0.13-0.16 mm. |
DAPI | Beyotime | C1006 | |
Dye vat | Several commercial brands available | 91347802 | |
Eosin Y, alcohol soluble | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 71014460 | |
Ether | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10009318 | |
Formaldehyde – aqueous solution | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10010018 | |
GSK923295 | MedChemExpress | HY-10299 | |
Hematoxylin, anhydrous | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 71020784 | |
ICR mouse | Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd | ||
Image J software | National Institutes of Health | https://imagej.nih.gov/ij/ | Fluorescent image analysis. |
Leica ultramicrotome | Leica | ||
Leica EM UC-7 ultramicrotome | Leica | EM UC7 | |
Modfit MFLT32 | Verity Software House | For analysis of flow cytometry results. | |
Nail polish | Several commercial brands available | ||
Neutral gum | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10004160 | |
Nikon Ti-S2 microscope | Nikon | Ti-S2 | |
Picric acid | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | J60807 | |
Rheodyne | Sangon Biotech | F519160-0001 | 10 μl rheodyne |
Sliced paraffin | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 69019461 | |
Sodium iodate | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 80117214 | |
Surgical instruments | Several commercial brands available | For abdominal surgery. Sterilize at 121 °C, 20 min. | |
Transmission electron microscope | FEI | Tecnai G2 | |
Trisodium citrate dihydrate | Shanghai Experiment Reagent Co., Ltd | 173970 | |
Triton X-100 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 30188928 | Dilute in sterile PBS to make a 0.25% working solution. |
Tween 20 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 30189328 | Dilute in sterile PBS to make a 0.1% working solution. |
Paraformaldehyde | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 80096618 | |
Xylene | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10023418 |