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Biologia

Funktionelle Bewertung von Kinesin-7 CENP-E in Spermatozyten mittels In-vivo-Inhibition , Immunfluoreszenz und Durchflusszytometrie

Published: December 28, 2021
doi:
10.3791/63271
, , , , , , ,
1Department of Cell Biology and Genetics, The School of Basic Medical Sciences,Fujian Medical University, 2Key Laboratory of Stem Cell Engineering and Regenerative Medicine,Fujian Province University, 3Fujian Obstetrics and Gynecology Hospital, 4Medical Research Center, Fujian Maternity and Child Health Hospital,Affiliated Hospital of Fujian Medical University

Summary

Dieser Artikel berichtet über eine in vivo Hemmung von CENP-E durch abdominale Chirurgie und Hodeninjektion von GSK923295, einem wertvollen Modell für die männliche meiotische Teilung. Mit Hilfe der Immunfluoreszenz-, Durchflusszytometrie- und Transmissionselektronenmikroskopie-Assays zeigen wir, dass die CENP-E-Hemmung zu Chromosomenfehlstellungen und Genominstabilität in Mausspermatozyten führt.

Abstract

Bei Eukaryoten ist die Meiose essentiell für die Stabilität des Genoms und die genetische Vielfalt bei der sexuellen Fortpflanzung. Experimentelle Analysen von Spermatozyten in Hoden sind entscheidend für die Untersuchung der Spindelbildung und der Chromosomensegregation bei der männlichen meiotischen Teilung. Die Spermatozyten der Maus sind ein ideales Modell für mechanistische Untersuchungen der Meiose, jedoch fehlen die effektiven Methoden für die Analyse von Spermatozyten. In diesem Artikel wird eine praktikable und effiziente Methode zur in vivo Hemmung von Kinesin-7 CENP-E in Mausspermatozyten vorgestellt. Es wird ein detailliertes Verfahren zur Hodeninjektion eines spezifischen Inhibitors GSK923295 durch abdominale Operationen an 3 Wochen alten Mäusen vorgestellt. Darüber hinaus wird hier eine Reihe von Protokollen für die Gewebeentnahme und -fixierung, die Hämatoxylin-Eosin-Färbung, die Immunfluoreszenz, die Durchflusszytometrie und die Transmissionselektronenmikroskopie beschrieben. In dieser Arbeit stellen wir ein in vivo Inhibitionsmodell mittels Bauchchirurgie und Hodeninjektion vor, das eine leistungsfähige Technik zur Untersuchung der männlichen Meiose sein könnte. Wir zeigen auch, dass die CENP-E-Inhibition zu einer Chromosomenfehlstellung und einem Metaphasenarrest in primären Spermatozyten während der Meiose I führt. Unsere In-vivo-Inhibitionsmethode wird mechanistische Studien der Meiose erleichtern, als nützliche Methode für genetische Modifikationen der männlichen Keimbahnen dienen und ein Licht auf zukünftige klinische Anwendungen werfen.

Introduction

Die Meiose ist eines der wichtigsten, hochrigide, evolutionär konservierten Ereignisse in eukaryotischen Organismen und ist essentiell für die Gametogenese, die sexuelle Fortpflanzung, die Integrität des Genoms und die genetische Vielfalt 1,2,3. Bei Säugetieren durchlaufen die Keimzellen nach einer einzigen DNA-Replikationsrunde zwei aufeinanderfolgende Zellteilungen, Meiose I und II. Im Gegensatz zu den Schwesterchromatiden in der Mitose paaren sich duplizierte homologe Chromosomen und trennen sich während der Meiose in zwei Tochterzellen I 4,5. Bei der Meiose II ziehen sich die Schwesterchromatiden auseinander und trennen sich, um haploide Gameten ohne DNA-Replikation zu bilden6. Fehler in einer der beiden meiotischen Teilungen, einschließlich Defekte in der Spindelanordnung und Fehlsegregation der Chromosomen, können zum Verlust von Gameten, Sterilität oder Aneuploidie-Syndromen führen 7,8,9.

Zunehmende Studien haben gezeigt, dass die Motoren der Kinesinfamilie eine entscheidende Rolle bei der Regulierung der Chromosomenausrichtung und -trennung, der Spindelmontage, der Zytokinese und des Zellzyklusfortschritts sowohl in mitotischen als auch in meiotischen Zellen spielen10,11,12. Kinesin-7 CENP-E (Zentromerprotein E) ist ein Plus-End-gerichteter Kinetochor-Motor, der für die Chromosomenkongression, den Chromosomentransport und -ausrichtung sowie die Regulierung des Spindelmontage-Checkpoints in der Mitose 13,14,15,16,17,18 erforderlich ist. Während der Meiose führt die CENP-E-Hemmung durch den spezifischen Inhibitor GSK923295 zu Zellzyklusarrest, Chromosomenfehlausrichtung, Spindeldesorganisation und Genominstabilität in spermatogenen Zellen19. Die Lokalisationsmuster und die Dynamik von CENP-E an den Zentromeren sich teilender Spermatozyten deuten darauf hin, dass CENP-E mit Kinetochorproteinen für die sequentielle Assemblierung von Zentromeren während der Meiose interagiertI 20,21. In Eizellen ist CENP-E für die Chromosomenanpassung und den Abschluss der Meiose I13,22,23 erforderlich. Die Injektion von Antikörpern oder Morpholinos von CENP-E führt zu falsch ausgerichteten Chromosomen, abnormaler Kinetochororientierung und Meiose-I-Arrest sowohl in Maus- als auch in Drosophila-Oozyten 23. Verglichen mit der essentiellen Rolle von CENP-E in der Mitose sind die Funktionen und Mechanismen von CENP-E in der Meiose noch weitgehend unbekannt. Detaillierte Mechanismen von CENP-E bei der Chromosomenkonstitution und Genomstabilität in männlichen meiotischen Zellen müssen noch geklärt werden.

Die Spermatogenese ist ein komplexer und langwieriger physiologischer Prozess, der sequentielle Proliferation der Spermatogonien, Meiose und Spermiogenese umfasst. Daher ist es außerordentlich schwierig, den gesamten Prozess in vitro in Säugetieren und anderen Spezies zu reproduzieren24,25. In vitro ist es nicht möglich, eine Differenzierung der Spermatozyten nach dem Pachytenstadium zu induzieren. Studien zur männlichen meiotischen Unterteilung beschränkten sich im Allgemeinen auf experimentelle Analysen der frühen meiotischen Prophase25,26. Trotz vieler technologischer Bemühungen, einschließlich der Kurzzeitkultur von Spermatozyten27,28 und Organkulturmethoden25, gibt es nur wenige effektive Methoden, um die männliche meiotische Teilung zu untersuchen. Darüber hinaus führt die genetische Deletion essentieller Gene in der Regel zu Entwicklungsstillstand und embryonaler Letalität. Zum Beispiel können sich Mausembryonen, denen CENP-E fehlt, nicht einnisten und können sich nicht über die Implantation hinausentwickeln 29, was ein Hindernis für mechanistische Studien von CENP-E in der Meiose darstellt. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Etablierung eines praktikablen und praktikablen Systems zur Untersuchung der männlichen meiotischen Teilung das Forschungsfeld der Meiose erheblich voranbringen kann.

Der kleinzelldurchlässige Inhibitor ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung von Kinesinmotoren bei Zellteilungs- und Entwicklungsprozessen. Der allosterische Inhibitor GSK923295 bindet spezifisch an die motorische Domäne von CENP-E, blockiert die Freisetzung von ADP (Adenosindiphosphat) und stabilisiert schließlich die Wechselwirkungen zwischen CENP-E und Mikrotubuli30. In dieser Studie wird ein in vivo Inhibitions-Mausmodell durch Bauchchirurgie und Hodeninjektion von GSK923295 vorgestellt. Die Hemmung von CENP-E führt zu einer Fehlstellung der Chromosomen in der Metaphase I der primären Spermatozyten. Darüber hinaus führt die CENP-E-Hemmung zu einem meiotischen Arrest der Spermatozyten und zur Störung der Spermatogenese. Es wird eine Reihe von Protokollen für die Analyse von Spermatozyten beschrieben, die zur Beobachtung von meiotischen Spindelmikrotubuli, homologen Chromosomen und subzellulären Organellen in Spermatozyten angewendet werden können. Unsere In-vivo-Inhibitionsmethode ist eine effektive Methode zur Untersuchung der meiotischen Teilung und Spermatogenese.

Protocol

Alle Tierversuche wurden vom Animal Care and Use Committee der Fujian Medical University geprüft und genehmigt (Protokollnummer SYXK 2016-0007). Alle Mausversuche wurden in Übereinstimmung mit den einschlägigen Richtlinien der Care and Use of Laboratory Animals der National Institutes of Health (NIH-Veröffentlichungsnummer 8023, überarbeitet 1978) durchgeführt. 1. Konstruktion von GSK923295-vermittelten CENP-E-Inhibitionsmausmodellen Sterilisieren Sie die chiru…

Representative Results

Es ist uns gelungen, ein in vivo CENP-E Inhibitionsmodell von Maushoden durch abdominale Chirurgie und Hodeninjektion von GSK92329519 zu konstruieren. Die wichtigsten technischen Schritte dieses Verfahrens sind in Abbildung 1 dargestellt. Nach einer Hodeninjektion von GSK923295 für 4 Tage wurden die Hoden für weitere Analysen entnommen. In der Kontrollgruppe war die spermatogene Welle in den Samenkanälchen regelmäßig und organisiert (<strong class="xfig"…

Discussion

In dieser Studie haben wir ein in vivo CENP-E Inhibitionsmodell von Maushoden unter Verwendung der abdominalen Chirurgie und der Mikroinjektion von GSK923295 etabliert. Die in dieser Studie verwendete Methode der Bauchchirurgie und Hodeninjektion hat die folgenden Vorteile. Erstens ist es nicht auf das Alter von Mäusen beschränkt. Experimentatoren können die Hodeninjektion in einem frühen Stadium durchführen, zum Beispiel bei 3 Wochen alten oder jüngeren Mäusen. Zweitens hat GSK923295 eine spezifische und…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken allen Mitgliedern des Cytoskeleton Laboratory an der Fujian Medical University für die hilfreichen Gespräche. Wir danken Jun-Jin Lin vom Public Technology Service Center der Fujian Medical University für die technische Unterstützung bei der Durchflusszytometrie. Wir danken Ming-Xia Wu und Lin-Ying Zhou vom Electron Microscopy Lab des Public Technology Service Center der Fujian Medical University für die technische Unterstützung bei der Elektronenmikroskopie. Wir danken Si-Yi Zheng, Ying Lin, Qi Ke und Jun Song vom Experimental Teaching Center of Basic Medical Sciences an der Fujian Medical University für ihre Unterstützung. Diese Studie wurde durch die folgenden Zuschüsse unterstützt: National Natural Science Foundation of China (Fördernummer 82001608), Naturwissenschaftliche Stiftung der Provinz Fujian, China (Fördernummer 2019J05071), Fujian Provincial Health Technology Project (Fördernummer 2018-1-69), Startup Fund for Scientific Research, Fujian Medical University (Fördernummer 2017XQ1001), Fujian Medical University High-Level Talents Anschubfinanzierungsprojekt für wissenschaftliche Forschung (Fördernummer XRCZX2017025) und Forschungsprojekt der Online-Ausbildung und des Unterrichts von Doktoranden der Chinesischen Medizin (Förderkennzeichen B-YXC20200202-06).

Materials

0.25% Trypsin-EDTA Gibco 25200056
1 ml Syringe Several commercial brands available Sterile.
1.5 mL Centrifuge tube Axygen MCT-150-C
50 mL Centrifuge Tube Corning 430828
6 cm Petri dish Corning 430166
95% Ethanol Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 10009164
tubulin rabbit polyclonal antibody Beyotime AF0001 For immunofluorescence assays. Use at 1:100.
rabbit anti-Histone H3 (phospho S10) monoclonal antibody Abcam ab267372 For immunofluorescence assays. Use at 1:100.
rabbit anti-TUBA4A polyclonal antibody Sangon Biotech D110022 For immunofluorescence assays. Use at 1:100.
Anti-SYCP3 rabbit monoclonal antibody Abcam ab175191 For immunofluorescence assays. Use at 1:100.
Adhesion microscope slides CITOTEST 188105
Alexa fluor 488-labeled goat anti-rabbit antibody Beyotime A0423 Sencodary antibody. Use at 1:500.
Aluminium potassium sulphate Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 10001060
Anhydrous ethanol Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 100092690
Anti-fade mounting medium Beyotime P0131 Prevent photobleching of flourescent signals.
BD FACS Canto II BD Biosciences FACS Canto II
Bovine Serum Albumin Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 69003435
Centrifuge Eppendorf 5424BK745380
Chloral hydrate Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 80037516
Citric acid Shanghai Experiment Reagent Co., Ltd 122670
Collagenase Sangon Biotech A004194-0100
Coverslips CITOTEST 10212020C 20 × 20 mm. Thickness 0.13-0.16 mm.
DAPI Beyotime C1006
Dye vat Several commercial brands available 91347802
Eosin Y, alcohol soluble Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 71014460
Ether Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 10009318
Formaldehyde – aqueous solution Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 10010018
GSK923295 MedChemExpress HY-10299
Hematoxylin, anhydrous Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 71020784
ICR mouse Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd
Image J software National Institutes of Health https://imagej.nih.gov/ij/ Fluorescent image analysis.
Leica ultramicrotome Leica
Leica EM UC-7 ultramicrotome Leica EM UC7
Modfit MFLT32 Verity Software House For analysis of flow cytometry results.
Nail polish Several commercial brands available
Neutral gum Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 10004160
Nikon Ti-S2 microscope Nikon Ti-S2
Picric acid Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd J60807
Rheodyne Sangon Biotech F519160-0001 10 μl rheodyne
Sliced paraffin Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 69019461
Sodium iodate Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 80117214
Surgical instruments Several commercial brands available For abdominal surgery. Sterilize at 121 °C, 20 min.
Transmission electron microscope FEI Tecnai G2
Trisodium citrate dihydrate Shanghai Experiment Reagent Co., Ltd 173970
Triton X-100 Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 30188928 Dilute in sterile PBS to make a 0.25% working solution.
Tween 20 Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 30189328 Dilute in sterile PBS to make a 0.1% working solution.
Paraformaldehyde Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 80096618
Xylene Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 10023418
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Riferimenti

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Xu, M., Yang, Y., Wei, Y., Zhang, J., Lin, X., Lin, X., Chen, H., She, Z. Functional Assessment of Kinesin-7 CENP-E in Spermatocytes Using In Vivo Inhibition, Immunofluorescence and Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (178), e63271, doi:10.3791/63271 (2021).
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