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Biologia

In Vivo Inhibition, Immunofluorescence 및 Flow Cytometry를 이용한 정자 세포 내 Kinesin-7 CENP-E의 기능 평가

Published: December 28, 2021
doi:
10.3791/63271
, , , , , , ,
1Department of Cell Biology and Genetics, The School of Basic Medical Sciences,Fujian Medical University, 2Key Laboratory of Stem Cell Engineering and Regenerative Medicine,Fujian Province University, 3Fujian Obstetrics and Gynecology Hospital, 4Medical Research Center, Fujian Maternity and Child Health Hospital,Affiliated Hospital of Fujian Medical University

Summary

이 기사는 남성 감수 분열에 대한 귀중한 모델인 복부 수술과 GSK923295의 고환 주사를 통한 CENP-E의 생체 내 억제를 보고합니다. 면역형광, 유세포 분석 및 투과 전자 현미경 분석을 사용하여 CENP-E 억제가 마우스 정자세포에서 염색체 정렬 불량 및 게놈 불안정성을 초래한다는 것을 보여줍니다.

Abstract

진핵생물에서 감수분열은 유성 생식의 게놈 안정성과 유전적 다양성에 필수적입니다. 고환의 정자 세포에 대한 실험적 분석은 남성 감수분열에서 방추 조립 및 염색체 분리를 조사하는 데 중요합니다. 마우스 정자 세포는 감수 분열의 기계론적 연구에 이상적인 모델이지만 정자 세포 분석을 위한 효과적인 방법이 부족합니다. 이 논문에서는 마우스 정자세포에서 kinesin-7 CENP-E의 생체 내 억제를 위한 실용적이고 효율적인 방법이 보고되어 있습니다. 3 주 된 마우스에서 복부 수술을 통해 GSK923295 특정 억제제의 고환 주사에 대한 자세한 절차가 제시됩니다. 또한, 여기에 설명된 것은 조직 수집 및 고정, 헤마톡실린-에오신 염색, 면역형광, 유세포 분석 및 투과 전자 현미경을 위한 일련의 프로토콜입니다. 여기에서 우리는 남성 감수분열을 연구하는 강력한 기술이 될 수 있는 복부 수술과 고환 주사를 통한 생체 내 억제 모델을 제시합니다. 우리는 또한 CENP-E 억제가 감수 분열 I 동안 일차 정자 세포에서 염색체 정렬 불량 및 중기 정지를 초래한다는 것을 입증합니다. 우리의 생체 내 억제 방법은 감수분열에 대한 기계론적 연구를 용이하게 하고, 남성 생식선의 유전자 변형에 유용한 방법으로 작용하며, 향후 임상 적용에 대한 빛을 비출 것입니다.

Introduction

감수 분열은 진핵 생물에서 가장 중요하고 매우 엄격하며 진화적으로 보존된 사건 중 하나이며 배우자 형성, 유성 생식, 게놈 무결성 및 유전적 다양성에 필수적입니다 1,2,3. 포유류에서 생식 세포는 단일 라운드의 DNA 복제 후 감수 분열 I과 II라는 두 가지 연속적인 세포 분열을 겪습니다. 유사분열의 자매 염색분체와 달리, 복제된 상동 염색체는 감수 분열 I 4,5 동안 쌍을 이루어 두 개의 딸 세포로 분리됩니다. 감수 분열 II에서 자매 염색분체는 분리되어 DNA 복제 없이 반수체 배우자를 형성합니다6. 방추 조립 결함 및 염색체 오분리를 포함한 두 감수 분열 중 하나의 실수는 배우자의 손실, 불임 또는 이수성 증후군을 초래할 수 있습니다 7,8,9.

축적된 연구에 따르면 키네신 계열 모터는 유사분열 세포와 감수분열 세포 모두에서 염색체 정렬 및 분리, 방추 조립, 사이토키네시스 및 세포 주기 진행의 조절에 중요한 역할을 하는 것으로 나타났습니다10,11,12. Kinesin-7 CENP-E(Centromere protein E)는 유사분열 13,14,15,16,17,18에서 염색체 의회, 염색체 수송 및 정렬, 방추 조립 체크포인트 조절에 필요한 플러스 엔드 지향 키네토코어 모터입니다. 감수 분열 동안, 특정 억제제에 의한 CENP-E 억제는 정자 형성 세포에서 세포 주기 정지, 염색체 정렬 불량, 방추체 해체 및 게놈 불안정성을 유발할 GSK923295 있다19. 분열하는 정자 세포의 중심체에서 CENP-E의 국소화 패턴과 역학은 CENP-E가 감수분열 동안 중심체의 순차적 조립을 위해 키네토코어 단백질과 상호 작용한다는 것을 나타냅니다. 난모세포에서 CENP-E는 염색체 정렬 및 감수분열 I 13,22,23의 완료에 필요합니다. 항체 또는 모르폴리노 주사 CENP-E는 염색체 정렬 불량, 비정상적인 키네토코어 배향, 감수분열 I 정지를 마우스와 초파리 난모세포 모두에서 초래한다23. 유사분열에서 CENP-E의 필수적인 역할과 비교할 때, 감수분열에서 CENP-E의 기능과 메커니즘은 거의 알려지지 않은 채로 남아 있습니다. 염색체 의회에서 CENP-E의 자세한 메커니즘과 남성 감수 분열 세포의 게놈 안정성은 아직 밝혀지지 않았습니다.

정자 형성은 순차적인 정자 증식, 감수 분열 및 정자 형성을 포함하는 복잡하고 오래 지속되는 생리학 과정입니다. 그러므로, 전체 과정은 포유류 및 다른 종에서 시험관 내에서 재현되는 것이 매우 어렵다24,25. 시험관 내에서 pachytene 단계 후에 정자 세포 분화를 유도하는 것은 불가능합니다. 남성 감수 분열에 대한 연구는 일반적으로 초기 감수 분열 prophase25,26의 실험적 분석으로 제한되었습니다. 정자 세포의 단기 배양 27,28 및 장기 배양 방법25을 포함한 많은 기술적 노력에도 불구하고 남성 감수 분열을 연구하는 효과적인 방법은 거의 없습니다. 또한, 필수 유전자의 유전적 결실은 일반적으로 발달 정지 및 배아 치사를 초래합니다. 예를 들어, CENP-E가 결핍된 마우스 배아는 착상에 실패하고 과거 착상이 발달할 수 없다29, 이는 감수분열에서 CENP-E의 기계론적 연구에 장애물이 된다. 종합하면, 남성 감수 분열을 연구하기 위한 실용적이고 실현 가능한 시스템을 구축하면 감수 분열 연구 분야를 크게 촉진할 수 있습니다.

작은 세포 투과성 억제제는 세포 분열 및 발달 과정에서 키네신 모터를 연구하는 강력한 도구입니다. 알로스테릭 억제제 GSK923295는 CENP-E 운동 도메인에 특이적으로 결합하여 ADP(아데노신 이인산)의 방출을 차단하고 최종적으로 CENP-E와 미세소관 사이의 상호작용을 안정화시킨다30. 본 연구에서는 복부 수술과 GSK923295의 고환 주사를 통해 생체 내 억제 마우스 모델을 제시한다. CENP-E 억제는 일차 정자 세포의 중기 I에서 염색체 정렬 불량을 초래합니다. 또한, CENP-E 억제는 정자 세포의 감수 분열 정지 및 정자 형성의 파괴를 초래합니다. 정자 세포 분석을 위해 일련의 프로토콜이 설명되며 정자 세포에서 감수 분열 방추 미세소관, 상동 염색체 및 세포내 소기관을 관찰하는 데 적용할 수 있습니다. 우리의 생체 내 억제 방법은 감수 분열 및 정자 형성 연구에 효과적인 방법입니다.

Protocol

모든 동물 실험은 복건 의과 대학의 동물 관리 및 사용위원회 (프로토콜 번호 SYXK 2016-0007)에 의해 검토되고 승인되었습니다. 모든 마우스 실험은 미국 국립보건원(NIH 간행물 번호 8023, 1978년 개정판)의 관련 가이드라인에 따라 수행하였다. 1. GSK923295 매개 CENP-E 억제 마우스 모델의 구성 수술 기구를 121°C에서 30분 동안 소독합니다. 수술용 울트라 클린 작업대…

Representative Results

복부 수술과GSK923295 19의 고환 주사를 통해 마우스 고환의 in vivo CENP-E 억제 모델을 성공적으로 구축했습니다. 이 방법의 주요 기술 단계는 그림 1에 나와 있습니다. 4일 동안 GSK923295의 고환 주사 후, 추가 분석을 위해 고환을 채취하였다. 대조군에서, 정세관의 정자 형성 파동은 규칙적이고 조직적이었다 (그림 2A). 그러나, GSK923295 …

Discussion

본 연구에서는 복부 수술과 GSK923295의 미세주입을 이용하여 마우스 고환의 in vivo CENP-E 억제 모델을 확립하였다. 본 연구에서 사용한 복부 수술 및 고환 주사 방법은 다음과 같은 장점이 있다. 첫째, 생쥐의 나이에 한정되지 않는다. 실험자는 초기 단계, 예를 들어 3 주 된 어린 마우스에서 고환 주사를 수행 할 수 있습니다. 둘째, GSK923295는 CENP-E에 특이적이고 우수한 억제 효과를 갖는다. 셋째,…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

유용한 토론을 해주신 Fujian Medical University의 Cytoskeleton Laboratory의 모든 구성원에게 감사드립니다. 유세포 분석에 대한 기술 지원을 해주신 Fujian Medical University Public Technology Service Center의 Jun-Jin Lin에게 감사드립니다. 전자 현미경에 대한 기술 지원을 위해 Fujian Medical University 공공 기술 서비스 센터 전자 현미경 연구실의 Ming-Xia Wu와 Lin-Ying Zhou에게 감사드립니다. Fujian Medical University의 기초 의학 실험 교육 센터의 Si-Yi Zheng, Ying Lin, Qi Ke 및 Jun Song의 지원에 감사드립니다. 이 연구는 다음과 같은 보조금의 지원을 받았습니다: 중국 국립 자연 과학 재단(보조금 번호 82001608), 중국 푸젠성 자연 과학 재단(보조금 번호 2019J05071), 복건성 보건 기술 프로젝트(보조금 번호 2018-1-69), 과학 연구 창업 기금, 복건 의과 대학(보조금 번호 2017XQ1001), 복건 의과 대학 고급 인재 과학 연구 창업 자금 지원 프로젝트(보조금 번호 XRCZX2017025) 및 연구 프로젝트 한의학 대학원생의 온라인 교육 및 교육(보조금 번호 B-YXC20200202-06).

Materials

0.25% Trypsin-EDTA Gibco 25200056
1 ml Syringe Several commercial brands available Sterile.
1.5 mL Centrifuge tube Axygen MCT-150-C
50 mL Centrifuge Tube Corning 430828
6 cm Petri dish Corning 430166
95% Ethanol Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 10009164
tubulin rabbit polyclonal antibody Beyotime AF0001 For immunofluorescence assays. Use at 1:100.
rabbit anti-Histone H3 (phospho S10) monoclonal antibody Abcam ab267372 For immunofluorescence assays. Use at 1:100.
rabbit anti-TUBA4A polyclonal antibody Sangon Biotech D110022 For immunofluorescence assays. Use at 1:100.
Anti-SYCP3 rabbit monoclonal antibody Abcam ab175191 For immunofluorescence assays. Use at 1:100.
Adhesion microscope slides CITOTEST 188105
Alexa fluor 488-labeled goat anti-rabbit antibody Beyotime A0423 Sencodary antibody. Use at 1:500.
Aluminium potassium sulphate Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 10001060
Anhydrous ethanol Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 100092690
Anti-fade mounting medium Beyotime P0131 Prevent photobleching of flourescent signals.
BD FACS Canto II BD Biosciences FACS Canto II
Bovine Serum Albumin Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 69003435
Centrifuge Eppendorf 5424BK745380
Chloral hydrate Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 80037516
Citric acid Shanghai Experiment Reagent Co., Ltd 122670
Collagenase Sangon Biotech A004194-0100
Coverslips CITOTEST 10212020C 20 × 20 mm. Thickness 0.13-0.16 mm.
DAPI Beyotime C1006
Dye vat Several commercial brands available 91347802
Eosin Y, alcohol soluble Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 71014460
Ether Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 10009318
Formaldehyde – aqueous solution Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 10010018
GSK923295 MedChemExpress HY-10299
Hematoxylin, anhydrous Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 71020784
ICR mouse Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd
Image J software National Institutes of Health https://imagej.nih.gov/ij/ Fluorescent image analysis.
Leica ultramicrotome Leica
Leica EM UC-7 ultramicrotome Leica EM UC7
Modfit MFLT32 Verity Software House For analysis of flow cytometry results.
Nail polish Several commercial brands available
Neutral gum Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 10004160
Nikon Ti-S2 microscope Nikon Ti-S2
Picric acid Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd J60807
Rheodyne Sangon Biotech F519160-0001 10 μl rheodyne
Sliced paraffin Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 69019461
Sodium iodate Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 80117214
Surgical instruments Several commercial brands available For abdominal surgery. Sterilize at 121 °C, 20 min.
Transmission electron microscope FEI Tecnai G2
Trisodium citrate dihydrate Shanghai Experiment Reagent Co., Ltd 173970
Triton X-100 Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 30188928 Dilute in sterile PBS to make a 0.25% working solution.
Tween 20 Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 30189328 Dilute in sterile PBS to make a 0.1% working solution.
Paraformaldehyde Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 80096618
Xylene Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 10023418
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Riferimenti

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Xu, M., Yang, Y., Wei, Y., Zhang, J., Lin, X., Lin, X., Chen, H., She, Z. Functional Assessment of Kinesin-7 CENP-E in Spermatocytes Using In Vivo Inhibition, Immunofluorescence and Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (178), e63271, doi:10.3791/63271 (2021).
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