В этой статье сообщается о ингибировании CENP-E in vivo с помощью абдоминальной хирургии и инъекции яичек GSK923295, ценной модели для мужского мейотического деления. Используя анализы иммунофлуоресценции, проточной цитометрии и просвечивающей электронной микроскопии, мы показываем, что ингибирование CENP-E приводит к смещению хромосом и нестабильности генома в сперматоцитах мышей.
У эукариот мейоз необходим для стабильности генома и генетического разнообразия при половом размножении. Экспериментальный анализ сперматоцитов яичек имеет решающее значение для изучения сборки веретена и сегрегации хромосом при мейотическом делении самцов. Сперматоцит мыши является идеальной моделью для механистических исследований мейоза, однако эффективные методы анализа сперматоцитов отсутствуют. В данной статье сообщается о практическом и эффективном методе ингибирования in vivo кинезина-7 CENP-E в сперматоцитах мышей. Представлена подробная процедура инъекции специфического ингибитора в яички GSK923295 с помощью абдоминальной хирургии у 3-недельных мышей. Кроме того, здесь описан ряд протоколов для сбора и фиксации тканей, окрашивания гематоксилин-эозином, иммунофлуоресценции, проточной цитометрии и просвечивающей электронной микроскопии. Здесь мы представляем модель торможения in vivo с помощью абдоминальной хирургии и инъекции яичек, которая может стать мощным методом изучения мужского мейоза. Мы также демонстрируем, что ингибирование CENP-E приводит к смещению хромосом и остановке метафазы в первичных сперматоцитах во время мейоза I. Наш метод ингибирования in vivo облегчит механистические исследования мейоза, послужит полезным методом для генетических модификаций мужских половых линий и прольет свет на будущие клинические применения.
Мейоз является одним из наиболее важных, очень жестких, эволюционно консервативных событий у эукариотических организмов и необходим для гаметогенеза, полового размножения, целостности генома и генетического разнообразия 1,2,3. У млекопитающих половые клетки подвергаются двум последовательным клеточным делениям, мейозу I и II, после одного раунда репликации ДНК. В отличие от сестринских хроматид при митозе, дублированные гомологичные хромосомы объединяются в пары и разделяются на две дочерние клетки во время мейоза I 4,5. При мейозе II сестринские хроматиды разрываются и разделяются, образуя гаплоидные гаметы без репликации ДНК6. Ошибки в любом из двух мейотических делений, включая дефекты сборки веретена и миссегрегацию хромосом, могут привести к потере гамет, синдромам бесплодия или анеуплоидии 7,8,9.
Накопленные исследования показали, что моторы семейства кинезинов играют решающую роль в регуляции выравнивания и сегрегации хромосом, сборки веретена, цитокинеза и прогрессирования клеточного цикла как в митотических клетках, так и в мейотических клетках10,11,12. Кинезин-7 CENP-E (центральномерный белок E) представляет собой кинетохорный двигатель, направленный на плюс-конец, необходимый для рассеивания хромосом, транспорта и выравнивания хромосом, а также для регуляции контрольной точки сборки шпинделя при митозе 13,14,15,16,17,18. Во время мейоза ингибирование CENP-E специфическим ингибитором GSK923295 приводит к остановке клеточного цикла, смещению хромосом, дезорганизации веретена и нестабильности генома в сперматогенных клетках19. Закономерности локализации и динамика CENP-E в центромерах делящихся сперматоцитов указывают на то, что CENP-E взаимодействует с белками кинетохоров для последовательной сборки центромер во время мейоза I20,21. В ооцитах CENP-E необходим для выравнивания хромосом и завершения мейоза I13,22,23. Инъекция антител или морфолино CENP-E приводит к смещению хромосом, аномальной ориентации кинетохора и остановке мейоза I как у мыши, так и у ооцитов дрозофилы 23. По сравнению с существенной ролью CENP-E в митозе, функции и механизмы CENP-E в мейозе остаются в значительной степени неизвестными. Детальные механизмы CENP-E в хромосомном конгрессе и стабильности генома в мужских мейотических клетках еще предстоит выяснить.
Сперматогенез представляет собой сложный и длительный физиологический процесс, включающий последовательную пролиферацию сперматогонии, мейоз и спермиогенез. Поэтому весь этот процесс чрезвычайно трудно воспроизвести in vitro у млекопитающих и других видов24,25. Индуцировать дифференцировку сперматоцитов после пахитеновой стадии in vitro невозможно. Исследования мужских мейотических делений, как правило, ограничивались экспериментальным анализом ранней мейотической профазы25,26. Несмотря на многие технологические усилия, в том числе кратковременное культивирование сперматоцитов27,28 и методы культивирования органов25, существует мало эффективных методов изучения мужского мейотического деления. Кроме того, генетическая делеция основных генов обычно приводит к остановке развития и эмбриональной летальности. Например, эмбрионы мышей, лишенные CENP-E, не имплантируются и не могут развиваться после имплантации29, что является препятствием для механистических исследований CENP-E в мейозе. Взятые вместе, создание практической и осуществимой системы для изучения мужского мейотического деления может значительно продвинуть область исследований мейоза.
Мелкоклеточный проницаемый ингибитор является мощным инструментом для изучения кинезиновых моторов в процессах деления и развития клеток. Аллостерический ингибитор GSK923295 специфически связывается с моторным доменом CENP-E, блокирует высвобождение АДФ (аденозиндифосфата) и, наконец, стабилизирует взаимодействие между CENP-E и микротрубочками30. В этом исследовании модель мыши с ингибированием in vivo представлена с помощью абдоминальной хирургии и инъекции яичек GSK923295. Ингибирование CENP-E приводит к смещению хромосом в метафазе I первичных сперматоцитов. Кроме того, ингибирование CENP-E приводит к мейотической остановке сперматоцитов и нарушению сперматогенеза. Описан ряд протоколов для анализа сперматоцитов, которые могут быть применены для наблюдения микротрубочек мейотического веретена, гомологичных хромосом и субклеточных органелл в сперматоцитах. Наш метод ингибирования in vivo является эффективным методом для изучения мейотического деления и сперматогенеза.
В этом исследовании мы создали модель ингибирования CENP-E in vivo яичек мыши с использованием абдоминальной хирургии и микроинъекции GSK923295. Абдоминальная хирургия и метод инъекций яичек, используемые в этом исследовании, имеют следующие преимущества. Во-первых, он не ограничивается во…
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим всех сотрудников лаборатории цитоскелета Медицинского университета Фуцзянь за полезные обсуждения. Мы благодарим Цзюнь-Цзинь Линя из Центра обслуживания общественных технологий Медицинского университета Фуцзянь за техническую помощь в проточной цитометрии. Мы благодарим Минг-Ся Ву и Линь-Ин Чжоу из Лаборатории электронной микроскопии Центра обслуживания общественных технологий Медицинского университета Фуцзянь за техническую помощь в электронной микроскопии. Мы благодарим Си-И Чжэн, Ин Линь, Ци Кэ и Цзюнь Сун из Экспериментального учебного центра фундаментальных медицинских наук Медицинского университета Фуцзянь за их поддержку. Это исследование было поддержано следующими грантами: Национальный фонд естественных наук Китая (грант No 82001608), Фонд естественных наук провинции Фуцзянь, Китай (номер гранта 2019J05071), Проект технологий здравоохранения провинции Фуцзянь (номер гранта 2018-1-69), Фонд стартапов для научных исследований, Медицинский университет Фуцзянь (номер гранта 2017XQ1001), Проект финансирования научных исследований высокого уровня талантов Медицинского университета Фуцзянь (грант No XRCZX2017025) и Исследовательский проект онлайн-образования и преподавания аспирантов китайской медицины (грант No B-YXC20200202-06).
0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
1 ml Syringe | Several commercial brands available | Sterile. | |
1.5 mL Centrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | |
50 mL Centrifuge Tube | Corning | 430828 | |
6 cm Petri dish | Corning | 430166 | |
95% Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10009164 | |
tubulin rabbit polyclonal antibody | Beyotime | AF0001 | For immunofluorescence assays. Use at 1:100. |
rabbit anti-Histone H3 (phospho S10) monoclonal antibody | Abcam | ab267372 | For immunofluorescence assays. Use at 1:100. |
rabbit anti-TUBA4A polyclonal antibody | Sangon Biotech | D110022 | For immunofluorescence assays. Use at 1:100. |
Anti-SYCP3 rabbit monoclonal antibody | Abcam | ab175191 | For immunofluorescence assays. Use at 1:100. |
Adhesion microscope slides | CITOTEST | 188105 | |
Alexa fluor 488-labeled goat anti-rabbit antibody | Beyotime | A0423 | Sencodary antibody. Use at 1:500. |
Aluminium potassium sulphate | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10001060 | |
Anhydrous ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 100092690 | |
Anti-fade mounting medium | Beyotime | P0131 | Prevent photobleching of flourescent signals. |
BD FACS Canto II | BD Biosciences | FACS Canto II | |
Bovine Serum Albumin | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 69003435 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5424BK745380 | |
Chloral hydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 80037516 | |
Citric acid | Shanghai Experiment Reagent Co., Ltd | 122670 | |
Collagenase | Sangon Biotech | A004194-0100 | |
Coverslips | CITOTEST | 10212020C | 20 × 20 mm. Thickness 0.13-0.16 mm. |
DAPI | Beyotime | C1006 | |
Dye vat | Several commercial brands available | 91347802 | |
Eosin Y, alcohol soluble | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 71014460 | |
Ether | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10009318 | |
Formaldehyde – aqueous solution | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10010018 | |
GSK923295 | MedChemExpress | HY-10299 | |
Hematoxylin, anhydrous | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 71020784 | |
ICR mouse | Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd | ||
Image J software | National Institutes of Health | https://imagej.nih.gov/ij/ | Fluorescent image analysis. |
Leica ultramicrotome | Leica | ||
Leica EM UC-7 ultramicrotome | Leica | EM UC7 | |
Modfit MFLT32 | Verity Software House | For analysis of flow cytometry results. | |
Nail polish | Several commercial brands available | ||
Neutral gum | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10004160 | |
Nikon Ti-S2 microscope | Nikon | Ti-S2 | |
Picric acid | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | J60807 | |
Rheodyne | Sangon Biotech | F519160-0001 | 10 μl rheodyne |
Sliced paraffin | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 69019461 | |
Sodium iodate | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 80117214 | |
Surgical instruments | Several commercial brands available | For abdominal surgery. Sterilize at 121 °C, 20 min. | |
Transmission electron microscope | FEI | Tecnai G2 | |
Trisodium citrate dihydrate | Shanghai Experiment Reagent Co., Ltd | 173970 | |
Triton X-100 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 30188928 | Dilute in sterile PBS to make a 0.25% working solution. |
Tween 20 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 30189328 | Dilute in sterile PBS to make a 0.1% working solution. |
Paraformaldehyde | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 80096618 | |
Xylene | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10023418 |