जेनोफस लेविस टैडपोल स्पाइनल कॉर्ड ट्रांसेक्शन रीढ़ की हड्डी की चोट और पुनर्जनन का अध्ययन करने के लिए एक प्रासंगिक चोट विधि है जो एक अनुप्रस्थ कटौती करके है जो वक्षीय स्तर पर रीढ़ की हड्डी को पूरी तरह से अलग कर देता है।
रीढ़ की हड्डी की चोट (एससीआई) एक स्थायी पीड़ा है, जो केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) मोटर और संवेदी नसों को प्रभावित करती है, जिसके परिणामस्वरूप चोट स्थल के नीचे पक्षाघात होता है। आज तक, एससीआई के लिए कोई कार्यात्मक वसूली चिकित्सा नहीं है, और एससीआई के बाद होने वाली कई परिसरों और गतिशील घटनाओं के बारे में स्पष्टता की कमी है। कई गैर-स्तनधारी जीव गंभीर एससीआई के बाद पुनर्जीवित हो सकते हैं, जैसे कि टेलीओस्ट मछलियां, यूरोडेल उभयचर, और अनुरान उभयचरों के लार्वा चरण, जिनमें ज़ेनोफस लेविस टैडपोल शामिल हैं। ये एससीआई की प्रतिक्रिया और सफल पुनर्योजी प्रक्रियाओं के अंतर्निहित तंत्र का अध्ययन करने और समझने के लिए वास्तविक मॉडल जीव हैं। इस प्रकार के शोध से एससीआई चिकित्सीय हस्तक्षेप के लिए संभावित लक्ष्यों की पहचान हो सकती है। यह आलेख वर्णन करता है कि कैसे Xenopus laevis tadpole रीढ़ की हड्डी transection, पशुपालन, सर्जरी, posturgery देखभाल, और कार्यात्मक परीक्षण मूल्यांकन सहित प्रदर्शन करने के लिए। इस चोट विधि को सेलुलर, आणविक और आनुवंशिक तंत्र, साथ ही एससीआई के बाद और रीढ़ की हड्डी के पुनर्जनन के दौरान हिस्टोलॉजिकल और कार्यात्मक विकास का अध्ययन करके रीढ़ की हड्डी के उत्थान के विभिन्न चरणों को स्पष्ट करने के लिए लागू किया जा सकता है।
रीढ़ की हड्डी की चोट (एससीआई) एक ऐसी पीड़ा है जो हर साल दुनिया भर में लगभग 250,000-500,000 लोगों को प्रभावित करती है। इस उच्च प्रसार के अलावा, एससीआई संवेदी और मोटर नसों को प्रभावित करता है, चोट साइट के नीचे पक्षाघात पैदा करता है और सीएनएस के नियंत्रण से कुछ आंतरिक अंगों का विच्छेदन करता है। रीढ़ की हड्डी, सीएनएस का एक हिस्सा, पुनर्जीवित नहीं हो सकता है, और पीड़ा की जटिलता और सभी शामिल प्रक्रियाओं की पूरी समझ की कमी के कारण, अभी भी कार्यात्मक वसूली की अनुमति देने वाले कोई कुशल उपचार नहीं हैं।
गैर-स्तनधारी जीव, जैसे कि टेलीओस्ट मछलियां, यूरोडेल उभयचर, और अनुरान उभयचरों के लार्वा चरण, जो गंभीर एससीआई 2,3,4 के बाद रीढ़ की हड्डी को पुनर्जीवित कर सकते हैं, उन प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए उत्कृष्ट मॉडल जीव हैं जो एक सफल पुनर्योजी घटना को नियंत्रित करते हैं और स्तनधारी पुनर्जनन की विफलता को समझते हैं। यह समझ बहुत रुचि की है क्योंकि यह एससीआई के लिए नए चिकित्सीय लक्ष्यों और संभावित उपचारों को विकसित करने के लिए मूल अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकती है।
अनुरान मेंढक, ज़ेनोफस लेविस, एससीआई का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल जीव है। इसमें टैडपोल चरणों के दौरान उत्कृष्ट पुनर्योजी क्षमताएं होती हैं, जो कायापलट के दौरान उत्तरोत्तर खो जाती हैं, जिससे पुनर्योजी और गैर-नियामक चरणों में प्रयोग की अनुमति मिलती है3,5। जेनोफस लेविस टैडपोल में एससीआई का अध्ययन करने के लिए स्थापित चोट विधि में पूंछ विच्छेदन होता है, जहां पूरी पूंछ को हटा दिया जाता है, जिसमें मांसपेशियों, नोटोकोर्ड और रीढ़ की हड्डी जैसे ऊतक शामिल हैं। यह दृष्टिकोण पुनर्योजी प्रक्रियाओं के सामान्य तंत्र की समझ में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई गई है4,7,8,9,10।
चूंकि पूंछ विच्छेदन में रीढ़ की हड्डी के अलावा कई ऊतक शामिल होते हैं, जो मानव एससीआई के बाद क्या होता है, एससीआई के अध्ययन के लिए एक अधिक प्रासंगिक चोट प्रतिमान की आवश्यकता होती है। हमने चोट के प्रतिमान5,12,13,14 और SCI12,13,14,14,15,16,17,18 के अध्ययन के लिए विभिन्न तरीकों के व्यापक विवरण उत्पन्न करने के लिए पिछले 11 में उपयोग किए गए अध्ययनों पर भरोसा किया है . रीढ़ की हड्डी के ट्रांससेक्शन के बाद, रीढ़ की हड्डी के पुच्छल भाग को आरएनए और प्रोटीन अभिव्यक्ति और उच्च-थ्रूपुट विश्लेषण 14,19,20,21 के लिए अलग किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, दवाओं और छोटे अणुओं के इंट्रासेलोमिक इंजेक्शन, साथ ही साथ सीडीएनए, आरएनए, या मॉर्फोलिनोस के इलेक्ट्रोपोरेशन, रीढ़ की हड्डी के ट्रांससेक्शन से पहले या बाद में, एससीआई की रोकथाम या उपचार में इन अणुओं के प्रभावों के अध्ययन की अनुमति देते हैं या एससीआई और रीढ़ की हड्डी के पुनर्जनन के बाद होने वाली विशिष्ट घटनाओं के अध्ययन की अनुमति देते हैं13,14 . इसके अलावा, चोट के विकास और पुनर्योजी प्रक्रियाओं का अध्ययन जैव रासायनिक, आणविक, हिस्टोलॉजिकल और कार्यात्मक दृष्टिकोण 12,13,14,17,19,20,21,22,23 का उपयोग करके चोट के बाद अलग-अलग समय पर किया जा सकता है।
अंत में, सभी उपर्युक्त तकनीकों का उपयोग गैर-पुनर्योजी चरणों में किया जा सकता है, जो एससीआई का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल जीव के रूप में ज़ेनोफस लेविस का उपयोग करने के सबसे महत्वपूर्ण फायदों में से एक को उजागर करता है, एक ही प्रजाति में पुनर्योजी और गैर-पुनर्योजी तंत्र के तुलनात्मक अध्ययन13,19,20,21,22। यह पेपर जेनोफस लेविस टैडपोल स्पाइनल कॉर्ड ट्रांससेक्शन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है, जो पुनर्योजी नियूवकूप और फेबर (एनएफ) चरण 50 टैडपोल के मंचन और चयन के साथ शुरू होता है। इसके बाद रीढ़ की हड्डी की सर्जरी के लिए प्रक्रियाओं का वर्णन किया जाता है ताकि शाम और ट्रांसेक्टेड जानवरों का उत्पादन किया जा सके, पोस्टसर्जिकल देखभाल, और अंत में मुफ्त टैडपोल तैराकी दूरी के माप द्वारा कार्यात्मक वसूली का विश्लेषण किया जा सके।
यहां वर्णित प्रोटोकॉल एससीआई करने और कार्यात्मक वसूली का मूल्यांकन करने के लिए एक उत्कृष्ट तरीका है। पुनरुत्पादन के लिए, स्वस्थ टैडपोल विकसित करना और उन जानवरों को चुनना आवश्यक है जो आकार में समान हैं। उचित भोजन की कमी पोषक तत्वों के तनाव को उत्पन्न करती है, जिसके परिणामस्वरूप खराब पुनर्योजी क्षमताएं होती हैं26; इसलिए, टैडपोल फीडिंग पर विशेष ध्यान दिया जाना चाहिए। जैसा कि टैडपोल 3-4 सप्ताह के बाद चरण 50 तक पहुंचते हैं, उन्हें विकास प्रक्रिया में तेजी लाने के लिए उच्च तापमान पर पाला जा सकता है, 18-25 डिग्री सेल्सियस इष्टतम 27 है। पानी की गुणवत्ता महत्वपूर्ण है, क्योंकि जानवर पानी की स्थिति और रासायनिक उत्पादों के प्रति संवेदनशील हैं। इष्टतम पानी की स्थिति में निम्नलिखित मापदंडों के साथ कार्बन फ़िल्टर किए गए, क्लोरीन मुक्त पानी का उपयोग करना शामिल है: पीएच (6.5-7.5), क्लोराइड (<0.02 मिलीग्राम / एल), पानी की चालकता (1.0 एमएस / सेमी ± 0.1 यूनिट), तांबा (<0.3 मिलीग्राम / एल); कार्बोनेट कठोरता (KH: 5-10 dKH); सामान्य कठोरता (GH: 6-16 dGH); नाइट्रेट (NO3: <20 मिलीग्राम / एल); और नाइट्राइट (NO2: <0.1 मिलीग्राम / एल) 14,27,28। इसके अतिरिक्त, संदूषण से बचने के लिए, प्लास्टिक टैंकों को सप्ताह में एक बार जानवरों के पालन के लिए या सर्जरी के बाद क्लोराइड मुक्त पानी और स्पंज के साथ अच्छी तरह से धोकर हर दूसरे दिन साफ किया जाना चाहिए; डिटर्जेंट से बचना चाहिए।
सर्जरी के बाद बेहतर जीवित रहने की दर के लिए, टैडपोल को लंबे समय तक संज्ञाहरण के संपर्क में नहीं आना चाहिए (2 मिनट से अधिक नहीं)। इसके अलावा, एक समय में एक टैडपोल को एनेस्थेटाइज़ करने की सिफारिश की जाती है। जैसा कि जानवरों को हाइड्रेटेड रहने की आवश्यकता होती है, सर्जरी से पहले और बाद में जानवरों को हर समय समाधान में डुबोए रखें, और सर्जरी शुरू करने से पहले टैडपोल के शीर्ष पर एक चम्मच के साथ समाधान डालें। सुनिश्चित करें कि क्षति पूरी रीढ़ की हड्डी को कवर करने के लिए पर्याप्त व्यापक है, लेकिन बहुत व्यापक नहीं है क्योंकि यह खराब कार्यात्मक वसूली या मृत्यु को प्रेरित कर सकती है। यदि notochord क्षतिग्रस्त हो जाता है, तो जानवर मुड़ा होगा, और कार्यात्मक वसूली प्रभावित होगी। यदि क्षति notochord से परे फैली हुई है, तो मृत्यु की संभावना बढ़ जाती है14। तैराकी परख के दौरान, रिकॉर्डिंग सही माना जाता है अगर सॉफ्टवेयर एक नीली छाया के साथ प्रत्येक जानवर की पहचान करता है; अन्यथा, रिकॉर्डिंग को दोहराया जाना चाहिए। रिकॉर्डिंग गलतियों को रोकने के लिए रिकॉर्डिंग प्रक्रिया के दौरान आंदोलन और हवा या प्रकाश परिवर्तनों से बचना महत्वपूर्ण है।
रीढ़ की हड्डी की क्षति और पुनर्जनन के अंतर्निहित सेलुलर और आणविक तंत्र के बारे में अभी भी कई खुले प्रश्न हैं। इस काम में वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग विभिन्न सेलुलर घटनाओं, जीन अभिव्यक्ति और कार्यात्मक वसूली पर उपचार के योगदान का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है, जो तैराकी क्षमताओं को मापने के द्वारा निर्धारित किया जाता है। इसके अतिरिक्त, कई अन्य तकनीकों को संचालित जानवरों पर लागू किया जा सकता है। रीढ़ की हड्डी को प्रोटीन और / या एमआरएनए निष्कर्षण करने के लिए अलग किया जा सकता है14 क्षति और उपचार के बाद प्रोटीन और जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल का अध्ययन करने के लिए 19,20। यह सर्जरी रीढ़ की हड्डी की सेलुलर प्रतिक्रिया 22 और रीढ़ की हड्डी की चोट के बाद तंत्रिका स्टेम पूर्वज कोशिकाओं के व्यवहार 12,13,22 के व्यवहार का अध्ययन करने का आधार भी रही है। रीढ़ की हड्डी के पुनर्जनन में शामिल सिग्नलिंग कैस्केड का भी अध्ययन किया गया है रीढ़ की हड्डी की क्षति प्रतिमान का उपयोग करके यहां वर्णित 23। संक्षेप में, यहां वर्णित प्रोटोकॉल रीढ़ की हड्डी की चोट और पुनर्जनन का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल है और इसका उपयोग कई अध्ययनों के लिए किया गया है जिन्होंने विषय के बारे में मौजूदा ज्ञान में योगदान दिया है।
The authors have nothing to disclose.
इस काम से अनुसंधान अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था: पीजी स्लेटर: FONDECYT N ° 3190820; जे Larraín: FONDECYT N° 1180429, केयर चिली यूसी-Centro de Envejecimiento y Regeneración (PFB 12/2007).
Air pump | Regent CALM | RC-006 | For oxygen diffuser stones function |
ANY-maze software | Stoelting | Swimming behavior test | |
Ca(NO3)2·4H2O | Sigma-Aldrich | 237124 | |
CaCl2·2H2O | Sigma-Aldrich | 223506 | |
Camera | Stoelting | 60528 | Swimming behavior test |
Computer | Swimming behavior test (minimum recommended specifications: PC, Windows 7, Intel Core i3, 2 GB RAM, 10-GB drive disk, 1 available USB port, 1,366 × 768 monitor) |
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Cysteine | Sigma-Aldrich | C7352 | |
Dissecting stereomicroscope | Nikon | SMZ745T | Surgery / staging |
Glass Petri dishes | 100 x 20 mm | ||
HEPES | Gibco | 11344-041 | |
Human chorionic gonadotropin | It can be found in different formats in the pharmacy | ||
KCl | Merck Millipore | 104936 | |
LED light box | custom made | wood box: 55-cm length, 34-cm width, 9-cm height, LED lights, transparent polystyrene sheet) | |
MgSO4·7H2O | Merck Millipore | 105886 | |
Microdissection scissors for transection | Fine Science Tools | 15003-08 | Spring Scissors for surgery |
MS-222 | Sigma-Aldrich | E10521 | Anesthetic; tricaine mesylate |
NaCl | Merck Millipore | 106404 | |
NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6014 | |
Nasco Frog Brittle for Tadpole Xenopus | Nasco | SB09480(LM)MX | Food for Xenopus tadpoles stage 44 to 60 |
Oxygen diffuser stones | Pentair | AA1 | Mantainance of animals |
Pair of forceps | Fine Science Tools | Dumont n° 5 SF forceps | For surgery |
Penicillin | Sigma-Aldrich | P7794 | |
pH meter | |||
Plastic Pasteur pipette | Sigma-Aldrich | Z331740 | For collecting embryos after mating |
Plastic Petri dishes | Sigma-Aldrich | P5981 | 150 x 15 mm |
Plastic tank/box with lid | 4.5 liter capacity; 20 cm × 17 cm × 15 cm or similar | ||
Sterilized gauze | |||
Streptomycin | Sigma-Aldrich | S1277 | |
Tablespoon | |||
Xenopus laevis specialized strains and lines |
National Xenopus Resource European Xenopus Resource Centre Xenopus laevis Research Resource Centre |
http://www.mbl.edu/xenopus https://xenopusresource.org/ https://www.urmc.rochester.edu/microbiology-immunology/xenopus-laevis.aspx |
|
Xenopus laevis wild type | Xenopus 1 Xenopus Express |
https://xenopus1.com http://www.xenopus.com |