Xenopus laevis tadpole ryggmärgstranssektion är en relevant skademetod för att studera ryggmärgsskada och regenerering genom att göra ett tvärgående snitt som helt skär av ryggmärgen på bröstnivå.
Ryggmärgsskada (SCI) är en permanent åkomma som påverkar centrala nervsystemet (CNS) motoriska och sensoriska nerver, vilket resulterar i förlamning under skadestället. Hittills finns det ingen funktionell återhämtningsterapi för SCI, och det finns en brist på klarhet när det gäller de många komplex och dynamiska händelser som inträffar efter SCI. Många icke-däggdjursorganismer kan regenerera efter svår SCI, såsom teleostfiskar, urodele-amfibier och larvstadier av anuranamfibier, inklusive Xenopus laevis tadpoles. Dessa är bona fide modellorganismer för att studera och förstå svaret på SCI och mekanismerna bakom framgångsrika regenerativa processer. Denna typ av forskning kan leda till identifiering av potentiella mål för SCI-terapeutisk intervention. Denna artikel beskriver hur man utför Xenopus laevis tadpole ryggmärgstranssektion, inklusive djurhållning, kirurgi, postkirurgisk vård och funktionell testutvärdering. Denna skademetod kan tillämpas för att belysa de olika stegen i ryggmärgsregenerering genom att studera de cellulära, molekylära och genetiska mekanismerna, såväl som histologisk och funktionell utveckling efter SCI och under ryggmärgsregenerering.
Ryggmärgsskada (SCI) är ett lidande som drabbar cirka 250 000-500 000 människor världen över varje år1. Förutom denna höga prevalens påverkar SCI sensoriska och motoriska nerver, vilket genererar förlamning under skadestället och frånkoppling av vissa inre organ från CNS: s kontroll. Ryggmärgen, en del av CNS, kan inte regenerera, och på grund av lidandets komplexitet och bristen på fullständig förståelse för alla involverade processer finns det fortfarande inga effektiva terapier som möjliggör funktionell återhämtning.
Icke-däggdjursorganismer, såsom teleostfiskar, urodele-amfibier och larvstadier av anuranamfibier, som kan regenerera ryggmärgen efter svår SCI2,3,4, är utmärkta modellorganismer för att studera de processer som styr en framgångsrik regenerativ händelse och förstå misslyckandet med däggdjursregenerering. Denna förståelse är av stort intresse eftersom den kan ge originella insikter för att utveckla nya terapeutiska mål och möjliga terapier för SCI.
Anurangrodan, Xenopus laevis, är en utmärkt modellorganism för att studera SCI. Den har utmärkt regenerativ kapacitet under grodyngelstadierna, som gradvis går förlorade under metamorfos, vilket möjliggör experiment i de regenerativa och icke-regenerativa stadierna3,5. Den etablerade skademetoden för att studera SCI i Xenopus laevis tadpoles består av svansamputation, där hela svansen avlägsnas, inklusive vävnader som muskler, notokord och ryggmärg6. Detta tillvägagångssätt har varit avgörande för förståelsen av allmänna mekanismer för regenerativa processer4,7,8,9,10.
Eftersom svansamputation involverar flera vävnader utöver ryggmärgen, vilket skiljer sig från vad som händer efter mänsklig SCI, behövs ett mer relevant skadeparadigm för studier av SCI. Vi har förlitat oss på studier som använts tidigare11 för att generera omfattande beskrivningar av skadeparadigmer5,12,13,14 och olika metoder för studier av SCI12,13,14,15,16,17,18 . Efter ryggmärgstranssektion kan den kaudala delen av ryggmärgen isoleras för RNA- och proteinuttryck och analyser med hög genomströmning14,19,20,21. Dessutom tillåter intracelomiska injektioner av läkemedel och små molekyler, liksom elektroporering av cDNA, RNA eller morfolinos, före eller efter ryggmärgstranssektion, studier av effekterna av dessa molekyler vid förebyggande eller behandling av SCI eller av specifika händelser som inträffar efter SCI och ryggmärgsregenerering13,14 . Vidare kan skadeutveckling och de regenerativa processerna studeras vid olika tidpunkter efter skada med hjälp av biokemiska, molekylära, histologiska och funktionella metoder12,13,14,17,19,20,21,22,23.
Slutligen kan alla ovannämnda tekniker användas i icke-regenerativa stadier, vilket belyser en av de viktigaste fördelarna med att använda Xenopus laevis som modellorganism för att studera SCI, de jämförande studierna av regenerativa och icke-regenerativa mekanismer hos samma art13,19,20,21,22. Detta dokument presenterar ett protokoll för Xenopus laevis tadpole ryggmärgstranssektion, som börjar med iscensättning och urval av regenerativa Nieuwkoop och Faber (NF) steg 50 grodyngel. Detta följs av beskrivningen av förfarandena för ryggmärgskirurgi för att producera falska och transekterade djur, postkirurgisk vård och slutligen analysen av funktionell återhämtning genom mätning av fritt tadpole-simavstånd.
Protokollet som beskrivs här är en utmärkt metod för att utföra SCI och utvärdera funktionell återhämtning. För reproducerbarhet är det viktigt att odla friska tadpoles och välja djur som är lika stora. Brist på korrekt utfodring genererar näringsstress, vilket resulterar i dålig regenerativ kapacitet26. Därför bör särskild uppmärksamhet ägnas åt tadpole utfodring. När grodyngel når steg 50 efter 3-4 veckor kan de födas upp vid högre temperaturer för att påskynda tillväxtprocessen, 18-25 ° C är optimal27. Vattenkvaliteten är viktig, eftersom djur är känsliga för vattenförhållanden och kemiska produkter. De optimala vattenförhållandena inkluderar användning av kolfiltrerat, klorfritt vatten med följande parametrar: pH (6,5-7,5), klorid (<0,02 mg / L), konduktivitet hos vatten (1,0 mS / cm ± 0,1 enheter), koppar (<0,3 mg / L); karbonathårdhet (KH: 5-10 dKH); allmän hårdhet (GH: 6-16 dGH); nitrat (NO3: <20 mg/l); och nitrit (NO2: <0,1 mg/L)14,27,28. För att undvika kontaminering bör plasttankar rengöras en gång i veckan för uppfödning av djur eller varannan dag efter operationen genom att tvätta noggrant med kloridfritt vatten och en svamp. tvättmedel måste undvikas.
För en bättre överlevnad efter operationen får grodyngel inte utsättas för anestesi under långa perioder (högst 2 minuter). Dessutom rekommenderas att bedöva en tadpole i taget. Eftersom djuren behöver hålla sig hydratiserade, håll djuren nedsänkta i lösning hela tiden före och efter operationen och häll lösningen med en sked ovanpå tadpole innan operationen påbörjas. Se till att skadan är tillräckligt omfattande för att täcka hela ryggmärgen men inte för omfattande eftersom det kan inducera dålig funktionell återhämtning eller död. Om notokordet är skadat kommer djuret att böjas och den funktionella återhämtningen påverkas. Om skadan sträcker sig bortom notokordet ökar sannolikheten för dödsfall14. Under simningsanalysen anses registreringen vara korrekt om programvaran identifierar varje djur med en blå skugga; annars bör inspelningen upprepas. Det är viktigt att undvika rörelse och luft- eller ljusförändringar under inspelningsprocessen för att förhindra inspelningsfel.
Det finns fortfarande många öppna frågor om de cellulära och molekylära mekanismerna bakom ryggmärgsskador och regenerering. Protokollet som beskrivs i detta arbete kan användas för att studera bidraget från olika cellulära händelser, genuttryck och behandlingar på funktionell återhämtning, bestämd genom att mäta simkapacitet. Dessutom kan många andra tekniker tillämpas på de opererade djuren. Ryggmärgen kan isoleras för att utföra protein- och/eller mRNA-extraktion14 för att studera protein- och genuttrycksprofiler efter skada och behandling19,20. Denna operation har också legat till grund för att studera ryggmärgscellulära svar22 och beteendet hos neurala stamstamceller12,13,22 efter ryggmärgsskada. Signalkaskader som är involverade i ryggmärgsregenerering har också studerats med hjälp av ryggmärgsskadeparadigmet som beskrivs häri23. Sammanfattningsvis är protokollet som beskrivs här en utmärkt modell för att studera ryggmärgsskada och regenerering och har använts för många studier som har bidragit till den befintliga kunskapen om ämnet.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete finansierades av forskningsbidrag från: PG Slater: FONDECYT N° 3190820; J. Larraín: FONDECYT N° 1180429, CARE Chile UC-Centro de Envejecimiento y Regeneración (PFB 12/2007).
Air pump | Regent CALM | RC-006 | For oxygen diffuser stones function |
ANY-maze software | Stoelting | Swimming behavior test | |
Ca(NO3)2·4H2O | Sigma-Aldrich | 237124 | |
CaCl2·2H2O | Sigma-Aldrich | 223506 | |
Camera | Stoelting | 60528 | Swimming behavior test |
Computer | Swimming behavior test (minimum recommended specifications: PC, Windows 7, Intel Core i3, 2 GB RAM, 10-GB drive disk, 1 available USB port, 1,366 × 768 monitor) |
||
Cysteine | Sigma-Aldrich | C7352 | |
Dissecting stereomicroscope | Nikon | SMZ745T | Surgery / staging |
Glass Petri dishes | 100 x 20 mm | ||
HEPES | Gibco | 11344-041 | |
Human chorionic gonadotropin | It can be found in different formats in the pharmacy | ||
KCl | Merck Millipore | 104936 | |
LED light box | custom made | wood box: 55-cm length, 34-cm width, 9-cm height, LED lights, transparent polystyrene sheet) | |
MgSO4·7H2O | Merck Millipore | 105886 | |
Microdissection scissors for transection | Fine Science Tools | 15003-08 | Spring Scissors for surgery |
MS-222 | Sigma-Aldrich | E10521 | Anesthetic; tricaine mesylate |
NaCl | Merck Millipore | 106404 | |
NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6014 | |
Nasco Frog Brittle for Tadpole Xenopus | Nasco | SB09480(LM)MX | Food for Xenopus tadpoles stage 44 to 60 |
Oxygen diffuser stones | Pentair | AA1 | Mantainance of animals |
Pair of forceps | Fine Science Tools | Dumont n° 5 SF forceps | For surgery |
Penicillin | Sigma-Aldrich | P7794 | |
pH meter | |||
Plastic Pasteur pipette | Sigma-Aldrich | Z331740 | For collecting embryos after mating |
Plastic Petri dishes | Sigma-Aldrich | P5981 | 150 x 15 mm |
Plastic tank/box with lid | 4.5 liter capacity; 20 cm × 17 cm × 15 cm or similar | ||
Sterilized gauze | |||
Streptomycin | Sigma-Aldrich | S1277 | |
Tablespoon | |||
Xenopus laevis specialized strains and lines |
National Xenopus Resource European Xenopus Resource Centre Xenopus laevis Research Resource Centre |
http://www.mbl.edu/xenopus https://xenopusresource.org/ https://www.urmc.rochester.edu/microbiology-immunology/xenopus-laevis.aspx |
|
Xenopus laevis wild type | Xenopus 1 Xenopus Express |
https://xenopus1.com http://www.xenopus.com |