Denne protokol beskriver metoderne til subkultur og kryopræservering af esophageal adenocarcinom organoider med og uden enkeltcelle fordøjelse for at gøre det muligt for forskere at vælge passende strategier baseret på deres eksperimentelle design.
Manglen på egnede translationelle forskningsmodeller, der afspejler primær sygdom til at udforske tumorgenese og terapeutiske strategier, er en stor hindring i esophageal adenocarcinom (EAC). Patientafledte organoider (PTO’er) har for nylig vist sig som en bemærkelsesværdig præklinisk model i en række kræftformer. Der er dog stadig begrænsede protokoller til rådighed til udvikling af ØK PPO’er. Når PPO’erne er etableret, er formering og kryopræservering afgørende for yderligere downstream-analyser. Her er to forskellige metoder blevet standardiseret for EAC PPO’er subkultur og kryopræservering, dvs. med og uden enkeltcellefordøjelse. Begge metoder kan pålideligt opnå passende cellelevedygtighed og kan anvendes til en forskelligartet forsøgsopstilling. Den nuværende undersøgelse viste, at subkulturering af EAC PPO’er med enkeltcellefordøjelse er velegnet til de fleste eksperimenter, der kræver cellenummerkontrol, ensartet tæthed og en hul struktur, der letter størrelsessporing. Den enkeltcellebaserede metode viser imidlertid langsommere vækst i kultur såvel som efter gendyrkning fra frosne bestande. Desuden er subkulturering med enkeltcellefordøjelse karakteriseret ved at danne hule strukturer med en hul kerne. I modsætning hertil er behandling af EAC PTO’er uden enkeltcellefordøjelse gunstig for kryokonservering, ekspansion og histologisk karakterisering. I denne protokol beskrives fordele og ulemper ved subkulturering og kryopræservering af EAC PTO’er med og uden enkeltcellefordøjelse for at gøre det muligt for forskere at vælge en passende metode til at behandle og undersøge deres organoider.
Spiserørkræft (EC) er den tiende mest almindelige og den sjette største dødsårsag fra kræft på verdensplan1. Esophageal adenocarcinom (EAC) er en af de vigtigste histologiske undertyper af EF og forekommer hovedsageligt i vestlige lande2. I det seneste årti er forekomsten af forhåndsræk steget betydeligt i mange udviklede lande, herunder Tyskland3. På grund af kræftens aggressivitet og manglen på symptomer i det tidlige stadium af tumorudvikling er den samlede prognose hos EAC-patienter dårlig, hvilket viser en 5-årig overlevelsesrate på ca. 20%2,4,5.
Siden slutningen af det tyvende århundrede er der etableret flere modeller for den biomedicinske forskning i EAC. De klassiske humane EAC-cellelinjer, der blev etableret i 1990’erne6, udvider vores viden om EAC-tumorbiologi, tumorgenetik samt antitumorstrategier og bruges almindeligvis i EAC-forskning. Desuden har nogle forskergrupper med succes udviklet dyremodeller af EAC eller Barretts spiserør ved at udsætte dyrene for kendte risikofaktorer som gastroøsofageal refluks gennem kirurgiske eller inflammatoriske tilgange 7,8,9. Derudover blev patientafledte xenograft (PDX) modeller, der indpodet EAC primære kræftvæv subkutant eller ortotopisk i immundefekte mus, udviklet til at simulere human EAC tumor biologisk adfærd og tumormiljø 10,11,12. På trods af disse modeller, der forbedrer kliniske anvendelser og vores forståelse af molekylære mekanismer bag EAC tumorgenese og progression, er der dog stadig en stor udfordring at ekstrapolere resultater fra disse forskningsmodeller til mennesker.
Patientafledte tumororganoider (PPO’er) dyrkes i et 3D-kultursystem, der efterligner menneskelig udvikling og organregenerering in vitro. Genereret fra patienternes primære væv rekapitulerer PPO’er de molekylære og fænotypiske egenskaber ved den humane tumor og har vist lovende anvendelser inden for lægemiddeludvikling og personlig kræftbehandling13,14. Ved at sammenligne ti tilfælde af EAC PDO’er med deres parrede tumorvæv rapporteres EAC PDO’er at dele lignende histopatologiske træk og genomisk landskab med den primære tumor, bevare intratumorheterogenitet og lette effektiv lægemiddelscreening in vitro15. EAC PDO’er blev også brugt til at studere interaktionen mellem EAC-tumorceller og patientafledte kræftassocierede fibroblaster (CAF’er), hvilket indikerer en stærk anvendelse inden for tumormikromiljøforskning16. Desværre har der været begrænsede protokoller til rådighed til udvikling og udbredelse af ØK PPO’er. Her beskrives to forskellige metoder til at subkulturere og bevare EAC PPO’er i detaljer: med og uden enkeltcellefordøjelse. De standardiserede metoder til vedligeholdelse af EAC PDO’er og deres anvendelser kan støtte forskere i at vælge passende metoder til forskellige formål i deres EAC BOB-forskning.
I denne protokol beskrives to forskellige subkultur- og kryopræserveringsmetoder for EAC PPO’er, dvs. med og uden enkeltcellefordøjelse. Flere undersøgelser anbefalede at videregive EAC PPO’er med enkeltcellefordøjelse15,17, hvilket er gavnligt for de fleste eksperimenter, der kræver cellenummerkontrol, ensartet tæthed og en hul struktur, der letter størrelsessporing. Den enkeltcellebaserede metode er imidlertid kendetegnet ved langsommere vækst efter rek…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af Köln Fortune Program / Det Medicinske Fakultet, Köln Universitet. Vi takker for den tekniske assistance fra Susanne Neiss, Michaela Heitmann og Anke Wienand-Dorweiler. Ningbo Fan blev økonomisk støttet af Guangzhou Elite Scholarship Council (GESC). Forfatterne takker Dr. Joshua D’Rozario for hans hjælp med sproglig redigering.
Equipment | |||
-20°C Freezer | Bosch | Economic | |
-80°C Freezer | Panasonic | MDF DU500VH-PE | |
Automated Cell counter | Thermo Fisher | AMQAX1000 | Countess II |
Biological Safety Cabinet Class II | Thermo Scientific | 51022482 | Herasafe KS12 |
Centrifuge | Heraeus | 75003060 | Megafuge 1.0R |
CO2 Incubator | Thermo Scientific | 50116048 | Heracell 150i |
Inverted automated fluorescence microscope | Olympus | IX83 | |
Inverted light microscope | Leica | DMIL LED Fluo | |
Pipette 1000 µL | Eppendorf | 3123000063 | Research Plus |
Pipette 200 µL | Eppendorf | 3123000039 | Research Plus |
Rotating Incubator | Scientific Industries, sc. | SI-1200 | Enviro-genie |
Shaker | Eppendorf | 5355 000.011 | Thermomixer Comfort |
Vacuum pump | Vacuubrand | 20727200 | BVC control |
Waterbath | Medingen | p2725 | W22 |
Material | |||
15 mL tube | Sarstedt | 62.554.502 | Inc Screw cap tube PP 15 mL |
Cryo vial 2 mL | Sarstedt | 72.379 | CryoPure 2.0 mL tube |
Low bind tube 1.5 mL | Sarstedt | 72.706.600 | Micro tube 1.5 mL protein LB |
Low bind tube 5 mL | Eppendorf | 0030 108.302 | Protein LoBind Tube 5.0 mL |
Pipette tip 200 µL | Starlab | E1011-8000 | 200 µL Graduated tip, wide orifice |
Pipette tip 1000 µL | Starlab | E1011-9000 | 1000 µL Graduated tip, wide orifice |
Pipette tip 1000 µL | Sarstedt | 70.3050 | Pipette tip 1000 µL |
Sterile filter 0.2 µm | Sarstedt | 83.1826.001 | Filtropur 0.2 µm sterile filter |
Tissue culture plate | Sarstedt | 83.3921 | 12 well-plate |
Reagent/Chemical | |||
A83-01 | Tocris | 2939 | |
Advanced DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12634010 | |
Amphotericin B | Thermo Fisher Scientific | 15290026 | |
B-27 | Thermo Fisher Scientific | 17504001 | |
Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
CHIR-99021 | MedChemExpress | HY-10182/CS-0181 | |
DNase I grade II, from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | 10104159001 | |
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190094 | |
Extracellular matrix (ECM) gel: Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | Corning | 356231 | |
FGF-10a | Peprotech | 100-26-100 | |
Freezing medium: Recovery Cell Freezing Medium | Thermo Fisher Scientific | 12648010 | |
Gastrin | Sigma | G9020 | |
Gentamicin-25 (25 mg/ 500 µL) | PromoCell | C-36030 | |
HEPES (1 M) | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
L-Glutamine 200 mM (100X) | Thermo Fisher Scientific | 25030024 | |
N-2 | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
N-Acetylcysteine | Sigma | A9165 | |
Nicotinamide | Sigma | N0636-100 | |
Noggin | Peprotech | 120-10C-50 | |
Penicillin-Streptomycin 10,000 U/ mL (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
Recombinant human epidermal growth factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | |
R-Spondin1 conditioned medium from Cultrex R-Spondin Cells | Biotechne | 3710-001-01 | |
SB202190 | MedChemExpress | 152121-30-7 | |
Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean) | Sigma-Aldrich | 93620-1G | |
Trypsin-EDTA (0.25 %), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
Wnt-3A conditioned medium | Wnt-3A expressing cell line was kindly provided by Prof. Hans Clevers' group | ||
Y-27632 | Sigma | Y0503 |