Sottocoltura e crioconservazione degli organoidi dell'adenocarcinoma esofageo: pro e contro per la digestione a cellula singola
Summary
Questo protocollo descrive i metodi di sottocoltura e crioconservazione degli organoidi dell’adenocarcinoma esofageo con e senza digestione a singola cellula per consentire ai ricercatori di scegliere strategie appropriate in base al loro disegno sperimentale.
Abstract
La mancanza di adeguati modelli di ricerca traslazionale che riflettano la malattia primaria per esplorare la tumorigenesi e le strategie terapeutiche è un grosso ostacolo nell’adenocarcinoma esofageo (EAC). Gli organoidi derivati dal paziente (DOP) sono recentemente emersi come un notevole modello preclinico in una varietà di tumori. Tuttavia, ci sono ancora protocolli limitati disponibili per lo sviluppo di DOP EAC. Una volta stabilite le DOP, la propagazione e la crioconservazione sono essenziali per ulteriori analisi a valle. Qui, due diversi metodi sono stati standardizzati per la sottocoltura e la crioconservazione delle DOP EAC, cioè con e senza digestione a singola cellula. Entrambi i metodi possono ottenere in modo affidabile un’appropriata vitalità cellulare e sono applicabili per una diversa configurazione sperimentale. L’attuale studio ha dimostrato che la subculturazione di DOP EAC con digestione a singola cellula è adatta per la maggior parte degli esperimenti che richiedono il controllo del numero di cellule, la densità uniforme e una struttura cava che facilita il monitoraggio delle dimensioni. Tuttavia, il metodo basato su singole cellule mostra una crescita più lenta in coltura e dopo la ri-coltivazione da stock congelati. Inoltre, la subculturazione con digestione a singola cellula è caratterizzata dalla formazione di strutture cave con un nucleo cavo. Al contrario, l’elaborazione di DOP EAC senza digestione a singola cellula è favorevole per la crioconservazione, l’espansione e la caratterizzazione istologica. In questo protocollo, vengono descritti i vantaggi e gli svantaggi della sottocoltura e della crioconservazione delle DOP EAC con e senza digestione monocellulare per consentire ai ricercatori di scegliere un metodo appropriato per elaborare e studiare i loro organoidi.
Introduction
Il cancro esofageo (EC) è la decima più comune e la sesta causa di morte per cancro in tutto il mondo1. L’adenocarcinoma esofageo (EAC) è uno dei principali sottotipi istologici della CE e si verifica principalmente nei paesi occidentali2. Nell’ultimo decennio, l’incidenza dell’EAC è aumentata significativamente in molti paesi sviluppati, tra cui la Germania3. A causa dell’aggressività del cancro e della mancanza di sintomi durante la fase iniziale dello sviluppo del tumore, la prognosi complessiva nei pazienti con EAC è scarsa, mostrando un tasso di sopravvivenza a 5 anni di circa il 20%2,4,5.
Dalla fine del XX secolo, sono stati stabiliti diversi modelli per la ricerca biomedica di EAC. Le classiche linee cellulari EAC umane che sono state stabilite nel 19906, estendono la nostra conoscenza della biologia tumorale EAC, genetica tumorale e strategie antitumorali, e sono comunemente usati nella ricerca EAC. Inoltre, alcuni gruppi di ricerca hanno sviluppato con successo modelli animali di EAC o esofago di Barrett esponendo gli animali a fattori di rischio noti come il reflusso gastroesofageo attraverso approcci chirurgici o infiammatori 7,8,9. Inoltre, sono stati sviluppati modelli di xenotrapianti derivati dal paziente (PDX) che innestano i tessuti tumorali primari EAC per via sottocutanea o ortotopica in topi immunodeficienti, per simulare il comportamento biologico del tumore EAC umano e l’ambiente tumorale 10,11,12. Tuttavia, nonostante questi modelli migliorino le applicazioni cliniche e la nostra comprensione dei meccanismi molecolari alla base della tumorigenesi e della progressione dell’EAC, c’è ancora una grande sfida per estrapolare i risultati di questi modelli di ricerca agli esseri umani.
Gli organoidi tumorali derivati dal paziente (DOP) vengono coltivati in un sistema di coltura 3D che imita lo sviluppo umano e la rigenerazione degli organi in vitro. Generate dal tessuto primario dei pazienti, le DOP ricapitolano le caratteristiche molecolari e fenotipiche del tumore umano e hanno mostrato applicazioni promettenti nello sviluppo di farmaci e nel trattamento personalizzato del cancro13,14. Confrontando dieci casi di EAC DOP con il loro tessuto tumorale accoppiato, le DOP EAC condividono caratteristiche istopatologiche e paesaggi genomici simili con il tumore primario, mantengono l’eterogeneità intratumorale e facilitano uno screening efficiente dei farmaci in vitro15. Le DOP EAC sono state utilizzate anche nello studio dell’interazione delle cellule tumorali EAC con i fibroblasti associati al cancro derivati dal paziente (CAF), indicando una potente applicazione nel campo della ricerca sul microambiente tumorale16. Sfortunatamente, sono stati disponibili protocolli limitati per lo sviluppo e la propagazione di DOP EAC. Qui, vengono descritti in dettaglio due diversi metodi per la subcoltura e la conservazione delle DOP EAC: con e senza digestione a singola cellula. I metodi standardizzati per il mantenimento delle DOP EAC e delle loro applicazioni possono aiutare i ricercatori a scegliere metodi appropriati per scopi diversi nella loro ricerca EAC DOP.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo protocollo, vengono descritti due diversi metodi di sottocoltura e crioconservazione delle DOP EAC, cioè con e senza digestione a singola cellula. Diversi studi hanno raccomandato il passaggio di EAC DOP con digestione a singola cellula15,17, che è utile per la maggior parte degli esperimenti che richiedono il controllo del numero cellulare, densità uniforme e una struttura cava che facilita il monitoraggio delle dimensioni. Tuttavia, il metodo basat…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dal Köln Fortune Program / Facoltà di Medicina, Università di Colonia. Ringraziamo l’assistenza tecnica di Susanne Neiss, Michaela Heitmann e Anke Wienand-Dorweiler. Ningbo Fan è stato sostenuto finanziariamente dal Guangzhou Elite Scholarship Council (GESC). Gli autori ringraziano il Dr. Joshua D’Rozario per la sua assistenza nell’editing linguistico.
Materials
| Equipment | |||
| -20°C Freezer | Bosch | Economic | |
| -80°C Freezer | Panasonic | MDF DU500VH-PE | |
| Automated Cell counter | Thermo Fisher | AMQAX1000 | Countess II |
| Biological Safety Cabinet Class II | Thermo Scientific | 51022482 | Herasafe KS12 |
| Centrifuge | Heraeus | 75003060 | Megafuge 1.0R |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | 50116048 | Heracell 150i |
| Inverted automated fluorescence microscope | Olympus | IX83 | |
| Inverted light microscope | Leica | DMIL LED Fluo | |
| Pipette 1000 µL | Eppendorf | 3123000063 | Research Plus |
| Pipette 200 µL | Eppendorf | 3123000039 | Research Plus |
| Rotating Incubator | Scientific Industries, sc. | SI-1200 | Enviro-genie |
| Shaker | Eppendorf | 5355 000.011 | Thermomixer Comfort |
| Vacuum pump | Vacuubrand | 20727200 | BVC control |
| Waterbath | Medingen | p2725 | W22 |
| Material | |||
| 15 mL tube | Sarstedt | 62.554.502 | Inc Screw cap tube PP 15 mL |
| Cryo vial 2 mL | Sarstedt | 72.379 | CryoPure 2.0 mL tube |
| Low bind tube 1.5 mL | Sarstedt | 72.706.600 | Micro tube 1.5 mL protein LB |
| Low bind tube 5 mL | Eppendorf | 0030 108.302 | Protein LoBind Tube 5.0 mL |
| Pipette tip 200 µL | Starlab | E1011-8000 | 200 µL Graduated tip, wide orifice |
| Pipette tip 1000 µL | Starlab | E1011-9000 | 1000 µL Graduated tip, wide orifice |
| Pipette tip 1000 µL | Sarstedt | 70.3050 | Pipette tip 1000 µL |
| Sterile filter 0.2 µm | Sarstedt | 83.1826.001 | Filtropur 0.2 µm sterile filter |
| Tissue culture plate | Sarstedt | 83.3921 | 12 well-plate |
| Reagent/Chemical | |||
| A83-01 | Tocris | 2939 | |
| Advanced DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12634010 | |
| Amphotericin B | Thermo Fisher Scientific | 15290026 | |
| B-27 | Thermo Fisher Scientific | 17504001 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
| CHIR-99021 | MedChemExpress | HY-10182/CS-0181 | |
| DNase I grade II, from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | 10104159001 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190094 | |
| Extracellular matrix (ECM) gel: Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | Corning | 356231 | |
| FGF-10a | Peprotech | 100-26-100 | |
| Freezing medium: Recovery Cell Freezing Medium | Thermo Fisher Scientific | 12648010 | |
| Gastrin | Sigma | G9020 | |
| Gentamicin-25 (25 mg/ 500 µL) | PromoCell | C-36030 | |
| HEPES (1 M) | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| L-Glutamine 200 mM (100X) | Thermo Fisher Scientific | 25030024 | |
| N-2 | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma | A9165 | |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100 | |
| Noggin | Peprotech | 120-10C-50 | |
| Penicillin-Streptomycin 10,000 U/ mL (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Recombinant human epidermal growth factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | |
| R-Spondin1 conditioned medium from Cultrex R-Spondin Cells | Biotechne | 3710-001-01 | |
| SB202190 | MedChemExpress | 152121-30-7 | |
| Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean) | Sigma-Aldrich | 93620-1G | |
| Trypsin-EDTA (0.25 %), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Wnt-3A conditioned medium | Wnt-3A expressing cell line was kindly provided by Prof. Hans Clevers' group | ||
| Y-27632 | Sigma | Y0503 |
Riferimenti
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