식도 선암종 오가노이드의 하위 배양 및 동결 보존 : 단일 세포 소화를위한 장단점
Summary
이 프로토콜은 단일 세포 소화가 있거나없는 식도 선암종 오가노이드의 계대 배양 및 냉동 보존 방법을 설명하여 연구자가 실험 설계에 따라 적절한 전략을 선택할 수 있도록합니다.
Abstract
종양 발생 및 치료 전략을 탐구하기 위해 원발성 질병을 반영하는 적절한 번역 연구 모델의 부족은 식도 선암종 (EAC)의 주요 장애물입니다. 환자 유래 오가노이드(PDOs)는 최근 다양한 암에서 주목할만한 전임상 모델로 부상하고 있다. 그러나 EAC PDO를 개발하는 데 사용할 수 있는 프로토콜은 여전히 제한적입니다. PDO가 확립되면 전파 및 냉동 보존은 추가 다운스트림 분석에 필수적입니다. 여기서, EAC PDOs 계대 배양 및 냉동 보존, 즉 단일 세포 소화 유무에 관계없이 두 가지 상이한 방법이 표준화되었다. 두 방법 모두 적절한 세포 생존력을 안정적으로 얻을 수 있으며 다양한 실험 설정에 적용 할 수 있습니다. 현재의 연구는 단일 세포 소화로 EAC PDO를 계대배양하는 것이 세포 수 조절, 균일 한 밀도 및 크기 추적을 용이하게하는 중공 구조를 필요로하는 대부분의 실험에 적합하다는 것을 보여주었습니다. 그러나, 단일 세포 기반 방법은 냉동 스톡으로부터 재배양 후뿐만 아니라 배양에서 느린 성장을 보여준다. 게다가, 단일 세포 소화로 계대 배양하는 것은 중공 코어로 중공 구조를 형성하는 것이 특징입니다. 대조적으로, 단일 세포 소화 없이 EAC PDO를 처리하는 것은 동결보존, 확장 및 조직학적 특성화에 유리하다. 이 프로토콜에서는 단일 세포 소화가 있거나없는 EAC PDO의 계대 배양 및 냉동 보존의 장단점을 설명하여 연구자가 오가노이드를 처리하고 조사하는 적절한 방법을 선택할 수 있도록합니다.
Introduction
식도암 (EC)은 전 세계적으로 암으로 인한 사망의 열 번째이자 여섯 번째 주요 원인입니다1. 식도 선암종 (EAC)은 EC의 주요 조직 학적 아형 중 하나이며 주로 서구 국가2에서 발생합니다. 최근 십 년 동안 EAC 발생률은 독일3을 포함한 많은 선진국에서 크게 증가했습니다. 암의 공격성과 종양 발달 초기 단계 동안의 증상 부족으로 인해 EAC 환자의 전반적인 예후는 좋지 않아 약 20 % 2,4,5의 5 년 생존율을 보여줍니다.
이십 세기 후반부터 EAC의 생물 의학 연구를 위해 몇 가지 모델이 수립되었습니다. 1990 년대6에 설립 된 고전적인 인간 EAC 세포주는 EAC 종양 생물학, 종양 유전학 및 항 종양 전략에 대한 지식을 확장하며 EAC 연구에 일반적으로 사용됩니다. 게다가, 일부 연구 그룹은 외과 적 또는 염증성 접근법 7,8,9을 통해 위식도 역류와 같은 알려진 위험 인자에 동물을 노출시킴으로써 EAC 또는 Barrett의 식도의 동물 모델을 성공적으로 개발했습니다. 또한, EAC 원발성 암 조직을 면역결핍 마우스에 피하 또는 직교적으로 이식하는 환자 유래 이종이식편(PDX) 모델은, 인간 EAC 종양 생물학적 거동 및 종양 환경을 시뮬레이션하기 위해 개발되었다(10,11,12). 그러나 이러한 모델이 임상 적용을 개선하고 EAC 종양 발생 및 진행의 분자 메커니즘에 대한 우리의 이해에도 불구하고 이러한 연구 모델의 결과를 인간으로 추정하는 데는 여전히 중요한 과제가 있습니다.
환자 유래 종양 오가노이드(PDO)는 시험관내에서 인간 발달 및 장기 재생을 모방하는 3D 배양 시스템에서 성장한다. 환자의 원발성 조직으로부터 생성된 PDO는 인간 종양의 분자 및 표현형 특성을 재해석하고 약물 개발 및 개인화된 암 치료에서 유망한 응용을 보여주었다(13,14). EAC PDO의 열 가지 사례를 쌍을 이룬 종양 조직과 비교함으로써, EAC PDO는 원발성 종양과 유사한 조직병리학적 특징 및 게놈 풍경을 공유하고, 종양 내 이질성을 유지하며, 시험관내15에서 효율적인 약물 스크리닝을 용이하게 하는 것으로 보고된다. EAC PDO는 또한 EAC 종양 세포와 환자 유래 암 관련 섬유아세포 (CAFs)의 상호작용을 연구하는데 사용되었으며, 이는 종양 미세환경 연구16 분야에서 강력한 응용을 나타낸다. 안타깝게도 EAC PDO를 개발하고 전파하는 데 사용할 수 있는 프로토콜은 제한적이었습니다. 여기에서, EAC PDO를 계대배양하고 보존하기 위한 두 가지 상이한 방법이 상세히 기술된다: 단일 세포 소화 유무에 관계없이. EAC PDO의 유지 보수를위한 표준화 된 방법 및 응용 프로그램은 연구자가 EAC PDO 연구에서 다양한 목적에 적합한 방법을 선택할 수 있도록 지원할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜에서, EAC PDOs의 두 가지 상이한 계대 배양 및 냉동 보존 방법, 즉 단일 세포 소화의 유무에 관계없이 설명된다. 여러 연구에서 단일 세포 소화15,17을 가진 EAC PDO를 통과 할 것을 권장했는데, 이는 세포 수 제어, 균일 한 밀도 및 크기 추적을 용이하게하는 중공 구조가 필요한 대부분의 실험에 유용합니다. 그러나, 단일 세포-기반 방법은 냉동 스…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 쾰른 대학 (University of Cologne)의 Köln Fortune Program / Faculty of Medicine의 지원을 받았습니다. Susanne Neiss, Michaela Heitmann 및 Anke Wienand-Dorweiler의 기술 지원에 감사드립니다. 닝보 팬은 광저우 엘리트 장학금위원회 (GESC)의 재정 지원을 받았다. 저자들은 Joshua D’Rozario 박사가 언어 편집에 도움을 준 것에 대해 감사드립니다.
Materials
| Equipment | |||
| -20°C Freezer | Bosch | Economic | |
| -80°C Freezer | Panasonic | MDF DU500VH-PE | |
| Automated Cell counter | Thermo Fisher | AMQAX1000 | Countess II |
| Biological Safety Cabinet Class II | Thermo Scientific | 51022482 | Herasafe KS12 |
| Centrifuge | Heraeus | 75003060 | Megafuge 1.0R |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | 50116048 | Heracell 150i |
| Inverted automated fluorescence microscope | Olympus | IX83 | |
| Inverted light microscope | Leica | DMIL LED Fluo | |
| Pipette 1000 µL | Eppendorf | 3123000063 | Research Plus |
| Pipette 200 µL | Eppendorf | 3123000039 | Research Plus |
| Rotating Incubator | Scientific Industries, sc. | SI-1200 | Enviro-genie |
| Shaker | Eppendorf | 5355 000.011 | Thermomixer Comfort |
| Vacuum pump | Vacuubrand | 20727200 | BVC control |
| Waterbath | Medingen | p2725 | W22 |
| Material | |||
| 15 mL tube | Sarstedt | 62.554.502 | Inc Screw cap tube PP 15 mL |
| Cryo vial 2 mL | Sarstedt | 72.379 | CryoPure 2.0 mL tube |
| Low bind tube 1.5 mL | Sarstedt | 72.706.600 | Micro tube 1.5 mL protein LB |
| Low bind tube 5 mL | Eppendorf | 0030 108.302 | Protein LoBind Tube 5.0 mL |
| Pipette tip 200 µL | Starlab | E1011-8000 | 200 µL Graduated tip, wide orifice |
| Pipette tip 1000 µL | Starlab | E1011-9000 | 1000 µL Graduated tip, wide orifice |
| Pipette tip 1000 µL | Sarstedt | 70.3050 | Pipette tip 1000 µL |
| Sterile filter 0.2 µm | Sarstedt | 83.1826.001 | Filtropur 0.2 µm sterile filter |
| Tissue culture plate | Sarstedt | 83.3921 | 12 well-plate |
| Reagent/Chemical | |||
| A83-01 | Tocris | 2939 | |
| Advanced DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12634010 | |
| Amphotericin B | Thermo Fisher Scientific | 15290026 | |
| B-27 | Thermo Fisher Scientific | 17504001 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
| CHIR-99021 | MedChemExpress | HY-10182/CS-0181 | |
| DNase I grade II, from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | 10104159001 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190094 | |
| Extracellular matrix (ECM) gel: Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | Corning | 356231 | |
| FGF-10a | Peprotech | 100-26-100 | |
| Freezing medium: Recovery Cell Freezing Medium | Thermo Fisher Scientific | 12648010 | |
| Gastrin | Sigma | G9020 | |
| Gentamicin-25 (25 mg/ 500 µL) | PromoCell | C-36030 | |
| HEPES (1 M) | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| L-Glutamine 200 mM (100X) | Thermo Fisher Scientific | 25030024 | |
| N-2 | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma | A9165 | |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100 | |
| Noggin | Peprotech | 120-10C-50 | |
| Penicillin-Streptomycin 10,000 U/ mL (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Recombinant human epidermal growth factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | |
| R-Spondin1 conditioned medium from Cultrex R-Spondin Cells | Biotechne | 3710-001-01 | |
| SB202190 | MedChemExpress | 152121-30-7 | |
| Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean) | Sigma-Aldrich | 93620-1G | |
| Trypsin-EDTA (0.25 %), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Wnt-3A conditioned medium | Wnt-3A expressing cell line was kindly provided by Prof. Hans Clevers' group | ||
| Y-27632 | Sigma | Y0503 |
Riferimenti
- Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).
- Coleman, H. G., Xie, S. -. H., Lagergren, J. The epidemiology of esophageal adenocarcinoma. Gastroenterology. 154 (2), 390-405 (2018).
- Rumgay, H., et al. International trends in esophageal squamous cell carcinoma and adenocarcinoma incidence. The American Journal of Gastroenterology. 116 (5), 1072-1076 (2021).
- Qian, H., et al. Clinical characteristics, prognosis, and nomogram for esophageal cancer based on adenosquamous carcinoma: a seer database analysis. Frontiers in Oncology. 11, 603349 (2021).
- Lagergren, J., Smyth, E., Cunningham, D., Lagergren, P. Oesophageal cancer. Lancet. 390 (10110), 2383-2396 (2017).
- Rockett, J. C., Larkin, K., Darnton, S. J., Morris, A. G., Matthews, H. R. Five newly established oesophageal carcinoma cell lines: phenotypic and immunological characterization. British Journal of Cancer. 75 (2), 258-263 (1997).
- Hashimoto, N. Expression of COX2 and p53 in rat esophageal cancer induced by reflux of duodenal contents. ISRN Gastroenterology. 2012, 1-5 (2012).
- Quante, M., et al. Bile acid and inflammation activate gastric cardia stem cells in a mouse model of barrett-like metaplasia. Cancer Cell. 21 (1), 36-51 (2012).
- Kapoor, H., Lohani, K. R., Lee, T. H., Agrawal, D. K., Mittal, S. K. Animal models of Barrett’s esophagus and esophageal adenocarcinoma-past, present, and future. Clinical and Translational Science. 8 (6), 841-847 (2015).
- Lan, T., Xue, X., Dunmall, L. C., Miao, J., Wang, Y. Patient-derived xenograft: a developing tool for screening biomarkers and potential therapeutic targets for human esophageal cancers. Aging. 13 (8), 12273-12293 (2021).
- Liu, D. S. H., et al. APR-246 potently inhibits tumour growth and overcomes chemoresistance in preclinical models of oesophageal adenocarcinoma. Gut. 64 (10), 1506-1516 (2015).
- Ebbing, E. A., et al. Esophageal adenocarcinoma cells and xenograft tumors exposed to Erb-b2 receptor tyrosine kinase 2 and 3 inhibitors activate transforming growth factor beta signaling, which induces epithelial to mesenchymal transition. Gastroenterology. 153 (1), 63-76 (2017).
- Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. The Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
- Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
- Li, X., et al. Organoid cultures recapitulate esophageal adenocarcinoma heterogeneity providing a model for clonality studies and precision therapeutics. Nature Communications. 9, 2983 (2018).
- Ebbing, E. A., et al. Stromal-derived interleukin 6 drives epithelial-to-mesenchymal transition and therapy resistance in esophageal adenocarcinoma. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (6), 2237-2242 (2019).
- Karakasheva, T. A., et al. Generation and characterization of patient-derived head and neck, oral, and esophageal cancer organoids. Current Protocols in Stem Cell Biology. 53 (1), 109 (2020).
- Ordóñez, N. G. Broad-spectrum immunohistochemical epithelial markers: a review. Human Pathology. 44 (7), 1195-1215 (2013).
- Maniar, K. P., Umpires, B. Cytokeratin 7 (CK7, K7). Pathology Outlines.com website. , (2021).
- Sun, X., Kaufman, P. D. Ki-67: more than a proliferation marker. Chromosoma. 127 (2), 175-186 (2018).
- Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications. Nature Protocols. 15 (10), 3380-3409 (2020).
- Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modeling. The EMBO Journal. 38 (4), 100300 (2019).
