Субкультура и криоконсервация органоидов аденокарциномы пищевода: плюсы и минусы одноклеточного пищеварения
Summary
Этот протокол описывает методы субкультуры и криоконсервации органоидов аденокарциномы пищевода с одноклеточным пищеварением и без него, чтобы позволить исследователям выбирать соответствующие стратегии на основе их экспериментального дизайна.
Abstract
Отсутствие подходящих трансляционных исследовательских моделей, отражающих первичное заболевание, для изучения опухолевого генеза и терапевтических стратегий является основным препятствием при аденокарциноме пищевода (EAC). Органоиды, полученные от пациентов (PDO), недавно стали замечательной доклинической моделью при различных видах рака. Тем не менее, по-прежнему существуют ограниченные протоколы, доступные для разработки EAC PDO. После того, как PDO установлены, распространение и криоконсервация имеют важное значение для дальнейшего последующего анализа. Здесь два различных метода были стандартизированы для субкультуры EAC PDO и криоконсервации, то есть с одноклеточным пищеварением и без него. Оба метода могут надежно получить соответствующую жизнеспособность клеток и применимы для разнообразной экспериментальной установки. Текущее исследование показало, что субкультурирование EAC PDO с одноклеточным пищеварением подходит для большинства экспериментов, требующих контроля количества клеток, равномерной плотности и полой структуры, которая облегчает отслеживание размера. Однако одноклеточный метод показывает более медленный рост культуры, а также после повторного культивирования из замороженных запасов. Кроме того, субкультура с одноклеточным пищеварением характеризуется образованием полых структур с полым ядром. Напротив, обработка EAC PDO без одноклеточного пищеварения благоприятна для криоконсервации, расширения и гистологической характеристики. В этом протоколе описаны преимущества и недостатки субкультуры и криоконсервации EAC PDO с одноклеточным пищеварением и без него, чтобы позволить исследователям выбрать подходящий метод обработки и исследования своих органоидов.
Introduction
Рак пищевода (ЭК) является десятой наиболее распространенной и шестой по значимости причиной смерти от рака во всем мире1. Аденокарцинома пищевода (ЭАС) является одним из основных гистологических подтипов ЭК и в основном встречается в западных странах2. В последнее десятилетие заболеваемость EAC значительно возросла во многих развитых странах, включая Германию3. Из-за агрессивности рака и отсутствия симптомов на ранней стадии развития опухоли общий прогноз у пациентов с ЭАС неблагоприятный, показывая 5-летнюю выживаемость около 20%2,4,5.
С конца двадцатого века было создано несколько моделей для биомедицинских исследований EAC. Классические клеточные линии EAC человека, которые были установлены в 1990-хгодах 6, расширяют наши знания о биологии опухолей EAC, генетике опухолей, а также противоопухолевых стратегиях и обычно используются в исследованиях EAC. Кроме того, некоторые исследовательские группы успешно разработали животные модели EAC или пищевода Барретта, подвергая животных воздействию известных факторов риска, таких как гастроэзофагеальный рефлюкс, с помощью хирургических или воспалительных подходов 7,8,9. Кроме того, модели ксенотрансплантата (PDX), полученные от пациента, которые прививают первичные раковые ткани EAC подкожно или ортотопически в иммунодефицитных мышей, были разработаны для моделирования биологического поведения опухоли EAC человека и опухолевой среды 10,11,12. Однако, несмотря на то, что эти модели улучшают клиническое применение и наше понимание молекулярных механизмов, лежащих в основе опухолевого генеза и прогрессирования EAC, по-прежнему существует серьезная проблема экстраполяции результатов этих исследовательских моделей на людей.
Полученные от пациента опухолевые органоиды (PDO) выращиваются в системе 3D-культур, которая имитирует развитие человека и регенерацию органов in vitro. Полученные из первичной ткани пациентов, PDO повторяют молекулярные и фенотипические характеристики опухоли человека и показали многообещающее применение в разработке лекарств и персонализированном лечении рака13,14. Сравнивая десять случаев EAC PDO с их парной опухолевой тканью, сообщается, что EAC PDO имеют сходные гистопатологические особенности и геномный ландшафт с первичной опухолью, сохраняют внутриопухолевую гетерогенность и облегчают эффективный скрининг лекарств in vitro15. EAC PDO также использовались при изучении взаимодействия опухолевых клеток EAC с полученными от пациента раковыми фибробластами (CAF), что указывает на мощное применение в области исследования микроокружения опухолей16. К сожалению, существуют ограниченные протоколы, доступные для разработки и распространения PDO EAC. Здесь подробно описаны два различных метода субкультурации и сохранения EAC PDO: с одноклеточным пищеварением и без него. Стандартизированные методы обслуживания EAC PDO и их приложений могут помочь исследователям выбрать подходящие методы для различных целей в своих исследованиях EAC PDO.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом протоколе описаны два различных метода субкультуры и криоконсервации КПК, т.е. с одноклеточным пищеварением и без него. В нескольких исследованиях рекомендовалось пропускать EAC PDO с одноклеточным пищеварением15,17, что полезно для большинства экспе?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана программой Köln Fortune / медицинским факультетом Кельнского университета. Мы благодарим за техническую помощь Сюзанну Нейсс, Микаэлу Хайтманн и Анке Винанд-Дорвейлер. Нинбо Фань получил финансовую поддержку от Совета элитных стипендий Гуанчжоу (GESC). Авторы благодарят доктора Джошуа Д’Розарио за помощь в лингвистическом редактировании.
Materials
| Equipment | |||
| -20°C Freezer | Bosch | Economic | |
| -80°C Freezer | Panasonic | MDF DU500VH-PE | |
| Automated Cell counter | Thermo Fisher | AMQAX1000 | Countess II |
| Biological Safety Cabinet Class II | Thermo Scientific | 51022482 | Herasafe KS12 |
| Centrifuge | Heraeus | 75003060 | Megafuge 1.0R |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | 50116048 | Heracell 150i |
| Inverted automated fluorescence microscope | Olympus | IX83 | |
| Inverted light microscope | Leica | DMIL LED Fluo | |
| Pipette 1000 µL | Eppendorf | 3123000063 | Research Plus |
| Pipette 200 µL | Eppendorf | 3123000039 | Research Plus |
| Rotating Incubator | Scientific Industries, sc. | SI-1200 | Enviro-genie |
| Shaker | Eppendorf | 5355 000.011 | Thermomixer Comfort |
| Vacuum pump | Vacuubrand | 20727200 | BVC control |
| Waterbath | Medingen | p2725 | W22 |
| Material | |||
| 15 mL tube | Sarstedt | 62.554.502 | Inc Screw cap tube PP 15 mL |
| Cryo vial 2 mL | Sarstedt | 72.379 | CryoPure 2.0 mL tube |
| Low bind tube 1.5 mL | Sarstedt | 72.706.600 | Micro tube 1.5 mL protein LB |
| Low bind tube 5 mL | Eppendorf | 0030 108.302 | Protein LoBind Tube 5.0 mL |
| Pipette tip 200 µL | Starlab | E1011-8000 | 200 µL Graduated tip, wide orifice |
| Pipette tip 1000 µL | Starlab | E1011-9000 | 1000 µL Graduated tip, wide orifice |
| Pipette tip 1000 µL | Sarstedt | 70.3050 | Pipette tip 1000 µL |
| Sterile filter 0.2 µm | Sarstedt | 83.1826.001 | Filtropur 0.2 µm sterile filter |
| Tissue culture plate | Sarstedt | 83.3921 | 12 well-plate |
| Reagent/Chemical | |||
| A83-01 | Tocris | 2939 | |
| Advanced DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12634010 | |
| Amphotericin B | Thermo Fisher Scientific | 15290026 | |
| B-27 | Thermo Fisher Scientific | 17504001 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
| CHIR-99021 | MedChemExpress | HY-10182/CS-0181 | |
| DNase I grade II, from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | 10104159001 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190094 | |
| Extracellular matrix (ECM) gel: Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | Corning | 356231 | |
| FGF-10a | Peprotech | 100-26-100 | |
| Freezing medium: Recovery Cell Freezing Medium | Thermo Fisher Scientific | 12648010 | |
| Gastrin | Sigma | G9020 | |
| Gentamicin-25 (25 mg/ 500 µL) | PromoCell | C-36030 | |
| HEPES (1 M) | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| L-Glutamine 200 mM (100X) | Thermo Fisher Scientific | 25030024 | |
| N-2 | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma | A9165 | |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100 | |
| Noggin | Peprotech | 120-10C-50 | |
| Penicillin-Streptomycin 10,000 U/ mL (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Recombinant human epidermal growth factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | |
| R-Spondin1 conditioned medium from Cultrex R-Spondin Cells | Biotechne | 3710-001-01 | |
| SB202190 | MedChemExpress | 152121-30-7 | |
| Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean) | Sigma-Aldrich | 93620-1G | |
| Trypsin-EDTA (0.25 %), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Wnt-3A conditioned medium | Wnt-3A expressing cell line was kindly provided by Prof. Hans Clevers' group | ||
| Y-27632 | Sigma | Y0503 |
Riferimenti
- Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).
- Coleman, H. G., Xie, S. -. H., Lagergren, J. The epidemiology of esophageal adenocarcinoma. Gastroenterology. 154 (2), 390-405 (2018).
- Rumgay, H., et al. International trends in esophageal squamous cell carcinoma and adenocarcinoma incidence. The American Journal of Gastroenterology. 116 (5), 1072-1076 (2021).
- Qian, H., et al. Clinical characteristics, prognosis, and nomogram for esophageal cancer based on adenosquamous carcinoma: a seer database analysis. Frontiers in Oncology. 11, 603349 (2021).
- Lagergren, J., Smyth, E., Cunningham, D., Lagergren, P. Oesophageal cancer. Lancet. 390 (10110), 2383-2396 (2017).
- Rockett, J. C., Larkin, K., Darnton, S. J., Morris, A. G., Matthews, H. R. Five newly established oesophageal carcinoma cell lines: phenotypic and immunological characterization. British Journal of Cancer. 75 (2), 258-263 (1997).
- Hashimoto, N. Expression of COX2 and p53 in rat esophageal cancer induced by reflux of duodenal contents. ISRN Gastroenterology. 2012, 1-5 (2012).
- Quante, M., et al. Bile acid and inflammation activate gastric cardia stem cells in a mouse model of barrett-like metaplasia. Cancer Cell. 21 (1), 36-51 (2012).
- Kapoor, H., Lohani, K. R., Lee, T. H., Agrawal, D. K., Mittal, S. K. Animal models of Barrett’s esophagus and esophageal adenocarcinoma-past, present, and future. Clinical and Translational Science. 8 (6), 841-847 (2015).
- Lan, T., Xue, X., Dunmall, L. C., Miao, J., Wang, Y. Patient-derived xenograft: a developing tool for screening biomarkers and potential therapeutic targets for human esophageal cancers. Aging. 13 (8), 12273-12293 (2021).
- Liu, D. S. H., et al. APR-246 potently inhibits tumour growth and overcomes chemoresistance in preclinical models of oesophageal adenocarcinoma. Gut. 64 (10), 1506-1516 (2015).
- Ebbing, E. A., et al. Esophageal adenocarcinoma cells and xenograft tumors exposed to Erb-b2 receptor tyrosine kinase 2 and 3 inhibitors activate transforming growth factor beta signaling, which induces epithelial to mesenchymal transition. Gastroenterology. 153 (1), 63-76 (2017).
- Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. The Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
- Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
- Li, X., et al. Organoid cultures recapitulate esophageal adenocarcinoma heterogeneity providing a model for clonality studies and precision therapeutics. Nature Communications. 9, 2983 (2018).
- Ebbing, E. A., et al. Stromal-derived interleukin 6 drives epithelial-to-mesenchymal transition and therapy resistance in esophageal adenocarcinoma. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (6), 2237-2242 (2019).
- Karakasheva, T. A., et al. Generation and characterization of patient-derived head and neck, oral, and esophageal cancer organoids. Current Protocols in Stem Cell Biology. 53 (1), 109 (2020).
- Ordóñez, N. G. Broad-spectrum immunohistochemical epithelial markers: a review. Human Pathology. 44 (7), 1195-1215 (2013).
- Maniar, K. P., Umpires, B. Cytokeratin 7 (CK7, K7). Pathology Outlines.com website. , (2021).
- Sun, X., Kaufman, P. D. Ki-67: more than a proliferation marker. Chromosoma. 127 (2), 175-186 (2018).
- Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications. Nature Protocols. 15 (10), 3380-3409 (2020).
- Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modeling. The EMBO Journal. 38 (4), 100300 (2019).
