自发荧光成像评估细胞代谢

Summary

该协议描述了内源性代谢辅酶，还原烟酰胺腺嘌呤（磷酸盐）二核苷酸（NAD（P）H）和氧化黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）的荧光成像和分析。NAD（P）H 和 FAD 的自发荧光成像提供了一种无标记、无损的方法来评估细胞代谢。

Abstract

细胞代谢是细胞产生能量的过程，许多疾病，包括癌症，都以异常代谢为特征。还原的烟酰胺腺嘌呤（磷酸盐）二核苷酸（NAD（P）H）和氧化的黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）是代谢反应的辅酶。NAD（P）H和FAD表现出自发荧光，可以通过激发和发射波长进行光谱隔离。辅酶NAD（P）H和FAD都可以以游离或蛋白质结合的构型存在，每种构型都具有不同的荧光寿命 – 荧光团保持在激发态的时间。荧光寿命成像（FLIM）可以量化NAD（P）H和FAD的荧光强度和寿命，以便对细胞代谢进行无标记分析。通过选择适当的激发和发射波长，可以针对 NAD（P）H 和 FAD 成像优化荧光强度和寿命显微镜。氰化物的代谢扰动验证了自发荧光成像方案，以检测细胞内的代谢变化。本文将展示NAD（P）H和FAD的自发荧光成像技术，用于测量细胞代谢。

Introduction

新陈代谢是产生能量的细胞过程。细胞代谢包括多种途径，包括糖酵解、氧化磷酸化和谷氨酰胺溶解。健康细胞利用这些代谢途径产生增殖和功能的能量，例如免疫细胞产生细胞因子。许多疾病，包括代谢紊乱、癌症和神经变性，其特征是细胞代谢改变¹。例如，即使在氧气存在下，某些癌细胞类型的糖酵解速率也较高，以产生用于合成核酸，蛋白质和脂质的分子^2，3。这种现象被称为Warburg效应，是许多癌症类型的标志，包括乳腺癌，肺癌和胶质母细胞瘤⁴。由于与癌症进展相关的细胞代谢的改变，细胞代谢可以成为药物反应的替代生物标志物^5，6。此外，在细胞水平上了解药物疗效至关重要，因为细胞异质性可导致个体中不同的药物反应^7，8。

识别和量化细胞代谢变化的技术对于癌症和药物反应的研究至关重要。化学和蛋白质分析用于评估细胞或组织的代谢，但缺乏单细胞分辨率和空间信息。基于代谢读板仪的测定可以测量样品中随时间推移的pH值和氧气消耗量以及随后化学物质的代谢扰动。pH值可用于计算细胞外酸化速率（ECAR），从而深入了解细胞的糖酵解活性⁹。全身成像方法，包括2-[氟-18]氟-D-葡萄糖正电子发射断层扫描（FDG PET）和磁共振波谱（MRS），是临床上用于通过代谢测量识别肿瘤复发和药物疗效的非侵入性成像方式^{10，11，12，13，14}。

FDG-PET成像了FDG的组织摄取，FDG是一种放射性标记的葡萄糖类似物。肿瘤相对于周围组织对FDG-PET的摄取增加是由于Warburg效应^12，13。MRS图像用于代谢的分子的常见核，如 ^13C和 ^31P，并且可以获得有关代谢如何响应刺激而变化的动态信息，如运动或饮食¹⁴。虽然FDG-PET和MRS可用于临床，但这些技术缺乏解决肿瘤内异质性的空间分辨率。同样，对大量细胞群进行耗氧量测量。自发荧光成像克服了这些技术的空间分辨率障碍，并提供了一种量化细胞代谢的非侵入性方法。

图1：常见代谢途径中的NADH和FAD。 NADH和FAD是用于糖酵解，克雷布斯循环和电子传递链的辅酶。这些分子的自发荧光成像提供有关细胞代谢的信息。 请点击此处查看此图的放大版本。

还原的烟酰胺腺嘌呤（磷酸盐）二核苷酸（NAD（P）H）和氧化的黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）是代谢反应的辅酶，包括糖酵解，氧化磷酸化和谷氨酰胺溶解（图1）。NAD（P）H 和 FAD 都是自发荧光的，为荧光成像提供内源性对比^1，15。NADPH具有与NADH相似的荧光特性。因此，NAD（P）H通常用于表示NADH和NADPH2^，16的组合信号。

荧光寿命成像（FLIM）量化荧光寿命或荧光团处于激发态的时间。荧光寿命对荧光团的微环境有反应，并提供有关细胞代谢的信息¹⁷。NAD（P）H和FAD可以存在于蛋白质结合或游离构象的细胞内，每种构象都有不同的寿命。游离NAD（P）H的寿命比蛋白质结合的NAD（P）H短;相反，自由 FAD 的寿命比绑定的 ^FAD18，19 长。寿命和寿命组分重量可以通过方程（1）²⁰从荧光寿命衰减数据进行量化：

I（t） = α ^1e-t/_τ1 + α _2e-t^/_τ2 + C （1）

等式（1）表示归一化的荧光强度作为时间的函数。该等式中的α ₁ 和α ₂ 分别表示短寿命和长寿命的比例分量（α ₁+α ₂=1），_τ1 和_τ2 分别代表短寿命和长寿命，C占背景光^7，20。振幅加权寿命（此处表示为_τm）是使用等式（2）计算的。

τm= α _1τ1+ α _2τ2 （2）

平均寿命可以通过在荧光团的强度衰变上平均“t”来计算，对于双指数衰减，方程（3）^17，21显示了该衰变。

τ*_m= （α _1τ12+ α _2τ22）/ （α _1τ1+ α _2τ2） （3）

通过积分荧光寿命衰减，可以从寿命图像中计算出荧光强度图像。自发荧光成像是一种无损且无标记的方法，可用于以亚细胞分辨率表征活细胞的代谢。光学氧化还原比提供电池化学氧化还原状态的光学模拟度量，并计算为NAD（P）H和FAD强度的比值。虽然计算光学氧化还原比的公式不是标准化的^{22，23，24，25}，但这里将其定义为FAD在NAD（P）H和FAD的组合强度上的强度。使用这个定义是因为分母中的总强度使度量归一化为0和1之间的度量，氰化物抑制的预期结果是氧化还原比的降低。游离 NAD（P）H 和 FAD 的荧光寿命可深入了解代谢溶剂微环境的变化，包括 pH、温度、与氧气的接近度和渗透压¹⁷。

NAD（P）H和FAD结合组分的荧光寿命变化可指示代谢途径利用和底物特异性代谢²⁶。组分权重可以解释为辅酶的自由到结合部分的变化^18，19。总而言之，这些定量的自发荧光寿命指标允许分析细胞代谢，并且自发荧光成像已用于识别正常组织中的肿瘤^27，28，表征干细胞^29，30，评估免疫细胞功能^{31，32，33，34，35}，测量神经活性^36，37，38，并了解药物在乳腺癌和头颈部癌症等癌症类型中的疗效^{21，39，40，41，42}。高分辨率自发荧光成像可与图像分割相结合，用于单细胞分析和种群内异质性量化^{43，44，45，46，47}。

NAD（P）H和FAD可以在配置为强度或寿命成像的单光子或多光子荧光显微镜上成像。对于单光子显微镜，NAD（P）H 和 FAD 通常分别在 375-405 nm 和 488 nm 波长处激发，因为这些波长处有常见的激光源⁴⁸。在双光子荧光激发中，NAD（P）H和FAD将分别在大约700至750nm和700至900nm的波长下激发^15，49。一旦荧光团被激发，NAD（P）H和FAD分别发射波长在~410 nm至~490nm和~510nm至~640nm之间的光子¹⁵。NAD（P）H 和 FAD 最大发射波长分别约为 450 nm 和 535 ^nm48。

由于它们的激发和发射波长不同，两种代谢辅酶的荧光可以被光谱分离。了解NAD（P）H和FAD的光谱特性对于设计和优化自发荧光成像方案是必要的。氰化物是一种电子传递链（ETC）复合IV抑制剂。氰化物对细胞代谢的影响以及细胞内NAD（P）H和FAD的自发荧光强度和寿命得到了很好的表征^27，40。因此，氰化物扰动实验是验证NAD（P）H和FAD成像方案的有效手段。成功的氰化物实验提供了NAD（P）H和FAD成像方案可用于评估未知组或扰动代谢的信心。

Protocol

1. 用于成像的细胞电镀 从80-90%汇合的MCF-7细胞的T-75烧瓶中吸出培养基，用10mL无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）冲洗细胞，并加入2mL0.25%胰蛋白酶（1x）以将细胞从烧瓶底部分离。 将烧瓶在37°C孵育约4分钟。在显微镜下检查细胞以确认脱离。 立即加入8mL培养基以停用胰蛋白酶。 将细胞收集在锥形管（15 mL或50 mL）中。使用血细胞计数器计数细胞。 将细胞?…

Representative Results

上皮乳腺癌细胞系MCF-7在补充有10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素 – 链霉素的DMEM中培养。对于荧光成像，在成像前48小时，将细胞以每35mm玻璃底成像培养皿4×105个细胞的密度接种。使用上述方案对细胞进行氰化物处理之前和之后进行成像。氰化物实验的目的是确认NAD（P）H和FAD荧光的光谱分离，并验证用于检测细胞代谢变化的成像系统和分析方案。配对的NAD（P）H和FAD荧光寿命图像在氰化物之?…

Discussion

自发荧光强度和终生成像已被广泛用于评估细胞的新陈代谢^21，55。FLIM具有高分辨率，因此可以解决单个细胞，这对于癌症研究很重要，因为细胞异质性有助于肿瘤侵袭性和耐药性^{7，39，41，44，45，46?…}

Materials

2-deoxy-d-glucose (2-DG)	Sigma	AC111980000; AC111980010; AC111980050; AC111980250
Antibiotic Antimicrobial (pen-strep)	Gibco	15240096
Cell Samples	American Type Culture Collection	N/A	MCF-7 cancer line
CellProfiler	Broad Institute	N/A	Image analysis software
Conical Tube	VWR	89039-664	15 mL conical tube
DMEM	ThermoFisher	11965092	Culture media
FAD dichroic mirror	Semrock	FF495-Di03-25×36	495 nm
FAD emission filter	Semrock	FF01-550/88-25	550/88 nm
FAD excitation filter	Semrock	FF01-458/64-25	458/64 nm
FBS	ThermoFisher	16000036
Fluorescence Lifetime Microscope	3i	N/A
Glass bottom dish	MatTek Corp	P35G-1.0-14-C
Multiphoton Laser	Coherent	N/A	2P Coherent Laser, Tunable 680 nm-1080 nm
NAD(P)H dichroic mirror	Semrock	FF409-Di03-25×36	409 nm
NAD(P)H emission filter	Semrock	FF02-447/60-25	447/60 nm
NAD(P)H excitation filter	Semrock	FF01-357/44-25	357/44 nm
PBS	ThermoFisher	70011044
Potassium Cyanide	Sigma-Aldrich	380970
SlideBooks 6	3i	N/A	Image acquisition software
SPCImage	Becker & Hickl GmbH	N/A	Fluorescence lifetime analysis software
Stage Top Incubator	okoLab	N/A
Trypsin	Biosciences	786-262
Urea	Sigma-Aldrich	U5128
YG beads	Polysciences	19096-2	Yg microspheres (20.0 µm)