Autofluoreszenzbildgebung zur Beurteilung des Zellstoffwechsels

Summary

Dieses Protokoll beschreibt die Fluoreszenzbildgebung und Analyse der endogenen metabolischen Coenzyme, des reduzierten Nicotinamidadenins (Phosphat) -Dinukleotids (NAD (P) H) und des oxidierten Flavinadenindinukleotids (FAD). Die Autofluoreszenzbildgebung von NAD(P)H und FAD bietet eine markierungsfreie, zerstörungsfreie Methode zur Beurteilung des Zellstoffwechsels.

Abstract

Der Zellstoffwechsel ist der Prozess, durch den Zellen Energie erzeugen, und viele Krankheiten, einschließlich Krebs, sind durch einen abnormalen Stoffwechsel gekennzeichnet. Reduziertes Nicotinamidadenin (Phosphat) Dinukleotid (NAD(P)H) und oxidiertes Flavinadenindinukleotid (FAD) sind Coenzyme von Stoffwechselreaktionen. NAD(P)H und FAD weisen Autofluoreszenz auf und können spektral durch Anregung und Emissionswellenlängen isoliert werden. Beide Coenzyme, NAD (P) H und FAD, können entweder in einer freien oder proteingebundenen Konfiguration vorliegen, von denen jedes eine ausgeprägte Fluoreszenzlebensdauer hat – die Zeit, für die das Fluorophor im angeregten Zustand verbleibt. Die Fluoreszenz-Lebensdauerbildgebung (FLIM) ermöglicht die Quantifizierung der Fluoreszenzintensität und Lebensdauer von NAD(P)H und FAD für eine markierungsfreie Analyse des Zellstoffwechsels. Fluoreszenzintensitäts- und Lebensdauermikroskope können für die Bildgebung von NAD(P)H und FAD optimiert werden, indem die geeigneten Anregungs- und Emissionswellenlängen ausgewählt werden. Metabolische Störungen durch Cyanid verifizieren Autofluoreszenz-Bildgebungsprotokolle, um metabolische Veränderungen in Zellen zu erkennen. Dieser Artikel demonstriert die Technik der Autofluoreszenzbildgebung von NAD(P)H und FAD zur Messung des Zellstoffwechsels.

Introduction

Stoffwechsel ist der zelluläre Prozess der Energieerzeugung. Der Zellstoffwechsel umfasst mehrere Wege, einschließlich Glykolyse, oxidative Phosphorylierung und Glutaminolyse. Gesunde Zellen nutzen diese Stoffwechselwege, um Energie für die Proliferation und Funktion zu erzeugen, wie zum Beispiel die Produktion von Zytokinen durch Immunzellen. Viele Krankheiten, einschließlich Stoffwechselstörungen, Krebs und Neurodegeneration, sind durch einen veränderten Zellstoffwechsel ^{gekennzeichnet1}. Zum Beispiel haben einige Krebszelltypen erhöhte Glykolyseraten, selbst in Gegenwart von Sauerstoff, um Moleküle für die Synthese von Nukleinsäuren, Proteinen und Lipiden zu ^erzeugen2,3. Dieses Phänomen, das als Warburg-Effekt bekannt ist, ist ein Kennzeichen vieler Krebsarten, einschließlich Brustkrebs, Lungenkrebs und Glioblastome4^. Aufgrund der Veränderungen des Zellstoffwechsels, die mit dem Fortschreiten der Krebserkrankung verbunden sind, kann der Zellstoffwechsel ein Surrogat-Biomarker für die Arzneimittelreaktion ^sein5,6. Darüber hinaus ist das Verständnis der Arzneimittelwirksamkeit auf zellulärer Ebene von entscheidender Bedeutung, da die Zellheterogenität bei Individuen zu unterschiedlichen Arzneimittelreaktionen führen ^kann7,8.

Technologien, die Veränderungen im Zellstoffwechsel identifizieren und quantifizieren, sind für Studien zu Krebs und Medikamentenreaktion unerlässlich. Chemische und Proteinanalysen werden verwendet, um den Stoffwechsel von Zellen oder Geweben zu bewerten, aber es fehlen Einzelzellauflösungen und räumliche Informationen. Metabolische Plattenleser-basierte Assays können den pH- und Sauerstoffverbrauch in der Probe im Laufe der Zeit und die anschließende metabolische Störung durch Chemikalien messen. Über den pH-Wert kann die extrazelluläre Versauerungsrate (ECAR) berechnet werden, die einen Einblick in die glykolytische Aktivität der Zellen ^gibt9. Bildgebende Ganzkörpermethoden, einschließlich 2-[Fluor-18] Fluor-D-Glucose-Positronen-Emissions-Tomographie (FDG PET) und Magnetresonanzspektroskopie (MRS), sind nichtinvasive Bildgebungsmodalitäten, die klinisch verwendet werden, um Tumorrezidive und Arzneimittelwirksamkeit durch metabolische Messungen zu identifizieren10,11,12,13,14.

FDG-PET bildet die Gewebeaufnahme von FDG, einem radioaktiv markierten Glukoseanalogon, ab. Die erhöhte Aufnahme von FDG-PET durch Tumore im Verhältnis zum umgebenden Gewebe ist auf den Warburg-Effekt ^{zurückzuführen12,13.} MRS bildet gemeinsame Kerne von Molekülen ab, die für den Stoffwechsel verwendet werden, wie ^13C und 31P, und kann dynamische Informationen darüber erhalten, wie sich der Stoffwechsel als Reaktion auf Reize wie Bewegung oder Essen ^{verändert14.} Obwohl FDG-PET und MRS klinisch eingesetzt werden können, fehlt diesen Technologien die räumliche Auflösung, um die intratumorale Heterogenität aufzulösen. Ebenso werden Sauerstoffverbrauchsmessungen an einer Massenpopulation von Zellen durchgeführt. Die Autofluoreszenzbildgebung überwindet das räumliche Auflösungshindernis dieser Technologien und bietet eine nichtinvasive Methode zur Quantifizierung des Zellstoffwechsels.

Abbildung 1: NADH und FAD in gemeinsamen Stoffwechselwegen. NADH und FAD sind Coenzyme, die in der Glykolyse, im Krebszyklus und in der Elektronentransportkette verwendet werden. Die Autofluoreszenzbildgebung dieser Moleküle liefert Informationen über den Zellstoffwechsel. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Reduziertes Nicotinamidadenin (Phosphat) Dinukleotid (NAD(P)H) und oxidiertes Flavinadenindinukleotid (FAD) sind Coenzyme von Stoffwechselreaktionen, einschließlich Glykolyse, oxidativer Phosphorylierung und Glutaminolyse (Abbildung 1). Sowohl NAD(P)H als auch FAD sind autofluoreszierend und bieten einen endogenen Kontrast für die Fluoreszenzbildgebung1,15. NADPH hat ähnliche fluoreszierende Eigenschaften wie NADH. Aus diesem Grund wird NAD(P)H häufig verwendet, um das kombinierte Signal von NADH und NADPH2,16 darzustellen.

Die Fluoreszenzlebensdauerbildgebung (FLIM) quantifiziert die Fluoreszenzlebensdauer oder die Zeit, für die sich ein Fluorophor im angeregten Zustand befindet. Fluoreszenzlebensdauern reagieren auf die Mikroumgebung der Fluorophore und liefern Informationen über den ^{Zellstoffwechsel17}. NAD(P)H und FAD können in Zellen entweder in proteingebundenen oder freien Konformationen existieren, von denen jede eine andere Lebensdauer hat. Freies NAD(P)H hat eine kürzere Lebensdauer als proteingebundenes NAD(P)H; Umgekehrt hat die freie FAD eine längere Lebensdauer als die gebundenen ^FAD18,19. Die Lebensdauern und Lebensdauerkomponentengewichte können aus Fluoreszenz-Lebensdauerzerfallsdaten durch Gl. (1)²⁰ quantifiziert werden:

I(t) = α _1e-t/τ1 + α ^_2e-t/_τ2 + C (1)

Eq (1) stellt die normierte Fluoreszenzintensität als Funktion der Zeit dar. Die α ₁ und α ₂ in dieser Gleichung stellen die proportionalen Komponenten der kurzen und langen Lebensdauer (α ₁+ α ₂=1) dar, _τ1 und _τ2 die kurze bzw. lange Lebensdauer und C das ^{Hintergrundlicht7,20}. Die amplitudengewichtete Lebensdauer, hier dargestellt als _τm, wird mit Gleichung (2) berechnet.

_τm= α _1τ1+ α _2τ2 (₂)

Eine mittlere Lebensdauer kann durch Mittelung von “t” über den Intensitätszerfall des Fluorophors berechnet werden, was für einen zweiexponentiellen Zerfall durch Gl. (3)^17,21 dargestellt wird.

τ*_m= (α 1τ12+ α ^2τ22)/ (α _1τ1+ α _2τ2) (3)

Ein Fluoreszenzintensitätsbild kann aus dem Lebensdauerbild berechnet werden, indem der Fluoreszenzlebensdauerzerfall integriert wird. Die Autofluoreszenzbildgebung ist eine zerstörungsfreie und markierungsfreie Methode, mit der der Stoffwechsel lebender Zellen mit subzellulärer Auflösung charakterisiert werden kann. Das optische Redoxverhältnis liefert eine optische Analogmetrik des chemischen Redoxzustands der Zelle und wird als Verhältnis von NAD(P)H- und FAD-Intensitäten berechnet. Obwohl die Formel zur Berechnung des optischen Redoxverhältnisses nicht standardisiert ^{ist22,23,24,25}, wird sie hier als die Intensität von FAD über die kombinierten Intensitäten von NAD(P)H und FAD definiert. Diese Definition wird verwendet, weil die summierte Intensität im Nenner die Metrik zwischen 0 und 1 normalisiert und das erwartete Ergebnis der Cyanidhemmung eine Abnahme des Redoxverhältnisses ist. Die Fluoreszenzlebensdauern von freiem NAD(P)H und FAD liefern Einblicke in Veränderungen in der metabolischen Lösungsmittelmikroumgebung, einschließlich pH-Wert, Temperatur, Nähe zu Sauerstoff und ^{Osmolarität17.}

Veränderungen in der Fluoreszenzlebensdauer der gebundenen Fraktionen von NAD(P)H und FAD können auf die Nutzung des Stoffwechselwegs und den substratspezifischen Stoffwechsel ^hinweisen26. Komponentengewichte können für Änderungen der freien zur gebundenen Fraktion der Coenzyme interpretiert ^werden18,19. Insgesamt ermöglichen diese quantitativen Autofluoreszenz-Lebenszeitmetriken die Analyse des Zellstoffwechsels, und die Autofluoreszenz-Bildgebung wurde zur Identifizierung von Neoplasmen aus normalem Gewebe verwendet27,28, zur Charakterisierung von Stammzellen29,30, zur Bewertung der Immunzellfunktion31,32,33,34,35^, zur Messung der neurologischen ^{Aktivität36, 37,38}, und Verständnis der Arzneimittelwirksamkeit bei Krebsarten wie Brustkrebs und Kopf-Hals-Krebs21,39,40,41,42. Hochauflösende Autofluoreszenzbildgebung kann mit Bildsegmentierung für die Einzelzellanalyse und Quantifizierung der intrapopulationären Heterogenität kombiniert werden43,44,45,46,47.

NAD(P)H und FAD können auf Einzelphotonen- oder Multiphotonen-Fluoreszenzmikroskopen abgebildet werden, die für die Intensitäts- oder Lebensdauerbildgebung konfiguriert sind. Bei Einzelphotonenmikroskopen werden NAD(P)H und FAD aufgrund üblicher Laserquellen bei diesen Wellenlängen typischerweise bei Wellenlängen von 375-405 nm bzw. 488 nm ^angeregt48. Bei der Zwei-Photonen-Fluoreszenzanregung werden NAD(P)H und FAD bei Wellenlängen von etwa 700 bis 750 nm bzw. 700 bis 900 nm bzw. ^15,49 anregen. Sobald die Fluorophore angeregt sind, emittieren NAD(P)H und FAD Photonen bei Wellenlängen zwischen ~410 nm bis ~490 nm bzw. ~510 nm bis ~^{640 nm15}. Die maximalen Emissionswellenlängen NAD(P)H und FAD betragen etwa 450 nm bzw. 535 nm48.

Aufgrund ihrer unterschiedlichen Anregungs- und Emissionswellenlängen kann die Fluoreszenz der beiden metabolischen Coenzyme spektral isoliert werden. Ein Verständnis der spektralen Eigenschaften von NAD(P)H und FAD ist für das Design und die Optimierung von Autofluoreszenz-Bildgebungsprotokollen notwendig. Cyanid ist ein Elektrontransportkette (ETC) -Komplex-IV-Inhibitor. Die Auswirkungen von Cyanid auf den Zellstoffwechsel und die Autofluoreszenzintensitäten und Lebensdauern von NAD(P)H und FAD in Zellen sind gut ^{charakterisiert27,40}. Daher ist ein Cyanid-Störungsexperiment ein wirksames Mittel zur Validierung von NAD(P)H- und FAD-Bildgebungsprotokollen. Ein erfolgreiches Cyanidexperiment gibt die Gewissheit, dass das NAD(P)H- und FAD-Bildgebungsprotokoll verwendet werden kann, um den Stoffwechsel unbekannter Gruppen oder Störungen zu beurteilen.

Protocol

1. Zellbeschichtung für die Bildgebung Saugen Sie das Medium aus einem 80-90% igen konfluierenden T-75-Kolben von MCF-7-Zellen ab, spülen Sie die Zellen mit 10 ml steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und fügen Sie 2 ml 0,25% Trypsin (1x) hinzu, um die Zellen vom Kolbenboden zu lösen. Den Kolben bei 37 °C für ~4 min inkubieren. Überprüfen Sie die Zellen unter dem Mikroskop, um die Ablösung zu bestätigen. Fügen Sie sofort 8 ml Kulturmedium hinzu, um da…

Representative Results

Die epitheliale Brustkrebs-Zelllinie, MCF-7, wurde in DMEM kultiviert, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin-Streptomycin. Für die Fluoreszenzbildgebung wurden die Zellen mit einer Dichte von 4 × 105 Zellen pro 35 mm Glasboden-Bildgebungsschale 48 h vor der Bildgebung ausgesät. Die Zellen wurden vor und nach der Cyanidbehandlung unter Verwendung der oben genannten Protokolle abgebildet. Ziel des Cyanidexperiments ist es, die spektrale Isolierung von NAD(P)H- und FAD-Fluoreszenz zu bes…

Discussion

Die Autofluoreszenzintensität und die lebenslange Bildgebung wurden häufig zur Beurteilung des Stoffwechsels in Zellen ^{eingesetzt21,55}. FLIM ist hochauflösend und löst daher einzelne Zellen auf, was für Krebsstudien wichtig ist, da die zelluläre Heterogenität zur Tumoraggression und Arzneimittelresistenz beiträgt7,39,41,44,45,46,58.^</…

Materials

2-deoxy-d-glucose (2-DG)	Sigma	AC111980000; AC111980010; AC111980050; AC111980250
Antibiotic Antimicrobial (pen-strep)	Gibco	15240096
Cell Samples	American Type Culture Collection	N/A	MCF-7 cancer line
CellProfiler	Broad Institute	N/A	Image analysis software
Conical Tube	VWR	89039-664	15 mL conical tube
DMEM	ThermoFisher	11965092	Culture media
FAD dichroic mirror	Semrock	FF495-Di03-25×36	495 nm
FAD emission filter	Semrock	FF01-550/88-25	550/88 nm
FAD excitation filter	Semrock	FF01-458/64-25	458/64 nm
FBS	ThermoFisher	16000036
Fluorescence Lifetime Microscope	3i	N/A
Glass bottom dish	MatTek Corp	P35G-1.0-14-C
Multiphoton Laser	Coherent	N/A	2P Coherent Laser, Tunable 680 nm-1080 nm
NAD(P)H dichroic mirror	Semrock	FF409-Di03-25×36	409 nm
NAD(P)H emission filter	Semrock	FF02-447/60-25	447/60 nm
NAD(P)H excitation filter	Semrock	FF01-357/44-25	357/44 nm
PBS	ThermoFisher	70011044
Potassium Cyanide	Sigma-Aldrich	380970
SlideBooks 6	3i	N/A	Image acquisition software
SPCImage	Becker & Hickl GmbH	N/A	Fluorescence lifetime analysis software
Stage Top Incubator	okoLab	N/A
Trypsin	Biosciences	786-262
Urea	Sigma-Aldrich	U5128
YG beads	Polysciences	19096-2	Yg microspheres (20.0 µm)