Autofluorescence Imaging for å evaluere cellulær metabolisme

Summary

Denne protokollen beskriver fluorescensavbildning og analyse av endogene metabolske koenzymer, redusert nikotinamid adenin (fosfat) dinukleotid (NAD(P)H) og oksidert flavin adenin dinukleotid (FAD). Autofluorescence imaging av NAD (P)H og FAD gir en etikettfri, ikke-ødeleggende metode for å vurdere cellulær metabolisme.

Abstract

Cellulær metabolisme er prosessen der celler genererer energi, og mange sykdommer, inkludert kreft, er preget av unormal metabolisme. Redusert nikotinamid adenin (fosfat) dinukleotid (NAD(P)H) og oksidert flavin adenin dinukleotid (FAD) er koenzymer av metabolske reaksjoner. NAD(P)H og FAD utviser autofluorescens og kan isoleres av eksitasjons- og utslippsbølgelengder. Både koenzymer, NAD (P)H og FAD, kan eksistere i enten en fri eller proteinbundet konfigurasjon, som hver har en tydelig fluorescens levetid – tiden som fluoroforen forblir i spent tilstand. Fluorescens livstidsavbildning (FLIM) tillater kvantifisering av fluorescensintensiteten og levetiden til NAD (P)H og FAD for etikettfri analyse av cellulær metabolisme. Fluorescensintensitet og livstidsmikroskop kan optimaliseres for avbildning av NAD(P)H og FAD ved å velge passende eksitasjons- og utslippsbølgelengder. Metabolske perturbasjoner ved cyanid verifiserer autofluorescence imaging protokoller for å oppdage metabolske endringer i celler. Denne artikkelen vil demonstrere teknikken for autofluorescence imaging av NAD (P)H og FAD for måling av cellulær metabolisme.

Introduction

Metabolisme er den cellulære prosessen med å produsere energi. Cellulær metabolisme omfatter flere veier, inkludert glykolyse, oksidativ fosforylering og glutaminolyse. Sunn celler bruker disse metabolske veiene for å generere energi til spredning og funksjon, for eksempel produksjon av cytokiner av immunceller. Mange sykdommer, inkludert metabolske forstyrrelser, kreft og nevrodegenerasjon, er preget av endret cellulær ^metabolisme1. For eksempel har noen kreftcelletyper forhøyede glykolysehastigheter, selv i nærvær av oksygen, for å generere molekyler for syntese av nukleinsyrer, proteiner og ^lipider2,3. Dette fenomenet, kjent som Warburg-effekten, er et kjennetegn på mange krefttyper, inkludert brystkreft, lungekreft og glioblastomer4. På grunn av endringene i cellulær metabolisme forbundet med kreftprogresjon, kan cellulær metabolisme være en surrogatbiomarkør for ^{legemiddelrespons5,6}. Videre er det avgjørende å forstå legemiddeleffekten på cellenivå, da celle heterogenitet kan føre til forskjellige legemiddelresponser hos ^personer7,8.

Teknologier som identifiserer og kvantifiserer endringer i cellulær metabolisme er avgjørende for studier av kreft og legemiddelrespons. Kjemiske og proteinanalyser brukes til å evaluere metabolismen av celler eller vev, men mangler encellet oppløsning og romlig informasjon. Metabolske plateleserbaserte analyser kan måle pH- og oksygenforbruk i prøven over tid og den påfølgende metabolske perturbasjonen av kjemikalier. pH kan brukes til å beregne den ekstracellulære forsuringshastigheten (ECAR), som gir et innblikk i cellenes glykolytiske ^aktivitet9. Avbildningsmetoder for hele kroppen, inkludert 2-[fluor-18] fluor-D-glukose positronutslippstomografi (FDG PET) og magnetisk resonansspektroskopi (MRS), er ikke-invasive avbildningsmodaliteter som brukes klinisk for å identifisere tumor gjentakelse og legemiddeleffekt gjennom metabolske målinger10,11,12,13,14.

FDG-PET tar bilder av vevsopptaket til FDG, en radiomerket glukoseanalog. Økt opptak av FDG-PET av svulster i forhold til omkringliggende vev skyldes Warburg-effekten12,13. MRS-bilder vanlige kjerner av molekyler som brukes til metabolisme, for eksempel ^13C og ^31P, og kan få dynamisk informasjon om hvordan metabolisme endres som respons på stimuli, for eksempel trening eller ^spising14. Selv om FDG-PET og MRS kan brukes klinisk, mangler disse teknologiene den romlige oppløsningen for å løse intratumoral heterogenitet. På samme måte gjøres oksygenforbruksmålinger på en bulkpopulasjon av celler. Autofluorescence imaging overvinner den romlige oppløsningen hinderet for disse teknologiene og gir en ikke-invasiv metode for kvantifisering av cellulær metabolisme.

Figur 1: NADH og FAD i vanlige metabolske veier. NADH og FAD er koenzymer som brukes i glykolyse, Krebs-syklusen og elektrontransportkjeden. Autofluorescence avbildning av disse molekylene gir informasjon om cellulær metabolisme. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Redusert nikotinamid adenin (fosfat) dinukleotid (NAD(P)H) og oksidert flavin adenin dinukleotid (FAD) er koenzymer av metabolske reaksjoner, inkludert glykolyse, oksidativ fosforylering og glutaminolyse (figur 1). Både NAD(P)H og FAD er autofluorescerende og gir endogen kontrast for fluorescensavbildning1,15. NADPH har lignende fluorescerende egenskaper som NADH. På grunn av dette brukes NAD(P)H ofte til å representere det kombinerte signalet til NADH og ^NADPH2,16.

Fluorescens livstidsavbildning (FLIM) kvantifiserer fluorescenslevetiden eller tiden som en fluorofor er i spent tilstand. Fluorescenslevetidene reagerer på mikromiljøet i fluoroforene og gir informasjon om cellulær ^{metabolisme17}. NAD(P)H og FAD kan eksistere i celler i enten proteinbundne eller frie konformasjoner, som hver har forskjellig levetid. Gratis NAD(P)H har kortere levetid enn proteinbundet NAD(P)H; på den annen side har fri FAD lengre levetid enn bundet ^FAD18,19. Levetids- og levetidskomponentvektene kan kvantifiseres fra fluorescenslevetidsforfallsdata gjennom Eq. (1)²⁰:

I(t) = α ^1e-t/_τ1 + α _2e-t^/_τ2 + C (1)

Eq (1) representerer den normaliserte fluorescensintensiteten som en tidsfunksjon. Den α ₁ og α ₂ i denne ligningen representerer de proporsjonale komponentene i kort og lang levetid (henholdsvis α ₁+ α ₂ = 1), henholdsvis _τ1 og _τ2 representerer henholdsvis korte og lange levetider, og C står for bakgrunnslys7,20. Den amplitudevektede levetiden, representert her som _τm, beregnes ved hjelp av Eq. (2).

τm= α _1τ1+ α _2τ2 (2)

En gjennomsnittlig levetid kan beregnes ved å beregne “t” over fluoroforens intensitetsforfall, som for et to eksponentielt forfall er vist av Eq. (3)^17,21.

τ*_m= (α _1τ12+ α _2τ22)/ (α _1τ1+ α _2τ2) (3)

Et fluorescensintensitetsbilde kan beregnes fra levetidsbildet ved å integrere fluorescenslevetidens forfall. Autofluorescence avbildning er en ikke-ødeleggende og etikettfri metode som kan brukes til å karakterisere metabolismen av levende celler med en subcellulær oppløsning. Det optiske redoksforholdet gir en optisk analog beregning av cellens kjemiske redokstilstand og beregnes som forholdet mellom NAD(P)H- og FAD-intensiteter. Selv om formelen for beregning av det optiske redoksforholdet ikke er standardisert22,23,24,25, er det her definert som intensiteten av FAD over de kombinerte intensitetene til NAD (P)H og FAD. Denne definisjonen brukes fordi den summerte intensiteten i nevneren normaliserer metrikkverdien mellom 0 og 1, og det forventede resultatet av cyanidinhiberingen er en reduksjon i redoksforholdet. Fluorescenslevetidene til fri NAD(P)H og FAD gir innsikt i endringer i det metabolske løsningsmiddelmikromiljøet, inkludert pH, temperatur, nærhet til oksygen og ^{osmolaritet17}.

Endringer i fluorescenslevetiden for de bundne fraksjonene av NAD(P)H og FAD kan indikere metabolsk baneutnyttelse og substratspesifikk ^{metabolisme26}. Komponentvekter kan tolkes for endringer i fri til den bundne brøkdelen av koenzymene18,19. Til sammen tillater disse kvantitative autofluorescence levetidsmålingene analysen av cellulær metabolisme, og autofluorescence imaging har blitt brukt til å identifisere neoplasmer fra normale ^vev27,28, karakterisere ^{stamceller29,30}, evaluere immuncellefunksjon31,32,33,34,35, måle nevrologisk ^{aktivitet36, 37,38}, og forstå legemiddeleffekt i krefttyper som brystkreft og hode- og nakkekreft21,39,40,41,42. Høyoppløselig autofluorescence-avbildning kan kombineres med bildesegmentering for encellet analyse og kvantifisering av intrapopulerings heterogenitet43,44,45,46,47.

NAD(P)H og FAD kan avbildes på enkeltfoton- eller multifotonfluorescensmikroskoper som er konfigurert for intensitet eller livstidsavbildning. For enkeltfotonmikroskoper er NAD(P)H og FAD vanligvis begeistret for bølgelengder på henholdsvis 375-405 nm og 488 nm på grunn av vanlige laserkilder ved disse ^{bølgelengdene48}. I to-foton fluorescens excitation, NAD (P)H og FAD vil begeistre ved bølgelengder på ca 700 til 750 nm og 700 til 900 nm, ^{henholdsvis15,49}. Når fluoroforene er begeistret, avgir NAD(P)H og FAD fotoner ved bølgelengder mellom ~ 410 nm til ~ 490 nm og ~ 510 nm til ~ 640 nm, ^{henholdsvis15}. NAD(P)H og FAD maxima utslipp bølgelengder er ca 450 nm og 535 nm, ^{henholdsvis48}.

På grunn av deres forskjellige eksitasjons- og utslippsbølgelengder, kan fluorescensen til de to metabolske koenzymene isoleres spektralt. En forståelse av spektralkarakteristikkene til NAD(P)H og FAD er nødvendig for design og optimalisering av autofluorescence imaging protokoller. Cyanid er en elektrontransportkjede (ETC) kompleks IV-hemmer. Effektene av cyanid på cellulær metabolisme og autofluorescensintensiteter og levetider for NAD(P)H og FAD i celler er godt ^{karakterisert27,40}. Derfor er et cyanidperturbasjonseksperiment et effektivt middel for å validere NAD(P)H- og FAD-bildebehandlingsprotokoller. Et vellykket cyanideksperiment gir tillit til at NAD(P)H- og FAD-bildebehandlingsprotokollen kan brukes til å vurdere metabolismen av ukjente grupper eller perturbasjoner.

Protocol

1. Cellebelegg for avbildning Aspirer mediet fra en 80-90% konfluent T-75 kolbe av MCF-7 celler, skyll cellene med 10 ml steril fosfatbufret saltvann (PBS), og tilsett 2 ml 0,25% trypsin (1x) for å løsne cellene fra kolbebunnen. Inkuber kolben ved 37 °C i ~4 min. Kontroller cellene under mikroskopet for å bekrefte løsrivelse. Tilsett umiddelbart 8 ml kulturmedium for å deaktivere trypsin. Samle cellene i et konisk rør (15 ml eller 50 ml). Tell cellene ved hj…

Representative Results

Den epiteliale brystkreftcellelinjen, MCF-7, ble dyrket i DMEM supplert med 10% foster bovint serum (FBS) og 1% penicillin-streptomycin. For fluorescensavbildning ble cellene sådd med en tetthet på 4 × 105 celler per 35 mm glassbunnavbildningsfat 48 timer før avbildning. Cellene ble avbildet før og etter cyanidbehandling ved hjelp av protokollene nevnt ovenfor. Målet med cyanideksperimentet er å bekrefte spektral isolering av NAD(P)H og FAD fluorescens og validere bildesystemet og analyseprotokollen for…

Discussion

Autofluorescence intensitet og livstidsavbildning har blitt mye brukt til å vurdere metabolisme i ^celler21,55. FLIM er høyoppløselig og løser derfor enkeltceller, noe som er viktig for kreftstudier fordi cellulær heterogenitet bidrar til tumor aggresjon og narkotikaresistens7,39,41,44,45,46,58.<su…

Materials

2-deoxy-d-glucose (2-DG)	Sigma	AC111980000; AC111980010; AC111980050; AC111980250
Antibiotic Antimicrobial (pen-strep)	Gibco	15240096
Cell Samples	American Type Culture Collection	N/A	MCF-7 cancer line
CellProfiler	Broad Institute	N/A	Image analysis software
Conical Tube	VWR	89039-664	15 mL conical tube
DMEM	ThermoFisher	11965092	Culture media
FAD dichroic mirror	Semrock	FF495-Di03-25×36	495 nm
FAD emission filter	Semrock	FF01-550/88-25	550/88 nm
FAD excitation filter	Semrock	FF01-458/64-25	458/64 nm
FBS	ThermoFisher	16000036
Fluorescence Lifetime Microscope	3i	N/A
Glass bottom dish	MatTek Corp	P35G-1.0-14-C
Multiphoton Laser	Coherent	N/A	2P Coherent Laser, Tunable 680 nm-1080 nm
NAD(P)H dichroic mirror	Semrock	FF409-Di03-25×36	409 nm
NAD(P)H emission filter	Semrock	FF02-447/60-25	447/60 nm
NAD(P)H excitation filter	Semrock	FF01-357/44-25	357/44 nm
PBS	ThermoFisher	70011044
Potassium Cyanide	Sigma-Aldrich	380970
SlideBooks 6	3i	N/A	Image acquisition software
SPCImage	Becker & Hickl GmbH	N/A	Fluorescence lifetime analysis software
Stage Top Incubator	okoLab	N/A
Trypsin	Biosciences	786-262
Urea	Sigma-Aldrich	U5128
YG beads	Polysciences	19096-2	Yg microspheres (20.0 µm)