小鼠后肢坏死模型中脚垫脉管系统的高分辨率三维成像
Summary
本方案描述了一种独特的、临床相关的外周动脉疾病模型，该模型将股动脉和静脉电凝与施用一氧化氮合酶抑制剂相结合，以诱导FVB小鼠的后肢坏疽。然后，心内DiI灌注用于脚垫脉管系统的高分辨率三维成像。
Abstract
外周动脉疾病 （PAD） 是慢性暴露于动脉粥样硬化危险因素导致的发病的重要原因。患有最严重形式的慢性威胁肢体缺血（CLTI）的患者面临日常生活的严重损害，包括慢性疼痛，行走距离有限而没有疼痛，以及伤口未愈合。已经开发了各种动物的临床前模型来研究PAD，但小鼠后肢缺血仍然是最广泛使用的。在这些模型中，对缺血性损伤的反应可能存在显着差异，具体取决于所使用的小鼠品系以及动脉破坏的部位，数量和手段。该协议描述了一种独特的方法，将股动脉和静脉电凝与施用一氧化氮合酶（NOS）抑制剂相结合，以可靠地诱导朋友病毒B（FVB）小鼠的脚垫坏疽，类似于CLTI的组织损失。虽然仍然推荐使用传统的评估再灌注的方法，如激光多普勒灌注成像（LDPI），但亲脂性染料1，1′-二十八烷基-3，3，3’，3′-四甲基高氯吲哚花青（DiI）的心内灌注用于标记脉管系统。随后的全安装共聚焦激光扫描显微镜允许对脚垫血管网络进行高分辨率，三维（3D）重建，以补充评估后肢缺血模型中再灌注的传统方法。
Introduction
外周动脉疾病 （PAD） 的特征是动脉粥样硬化导致四肢血流量减少，影响美国 650 万人和全球 2 亿人1。PAD 患者的肢体功能和生活质量下降，而患有 CLTI（最严重的 PAD 形式）的患者截肢和死亡风险增加，5 年死亡率接近 50%2。在临床实践中，踝臂指数 （ABI） <0.9 的患者被认为患有 PAD，而与静息痛或组织丢失相关的 ABI <.4 的患者则认为患有 CLTI3。具有相似 ABI 的患者的症状因日活动、肌肉对缺血的耐受性、解剖学变异和侧支发育差异而异4。指和肢体坏疽是导致CLTI的所有血管闭塞性疾病的最严重表现。它是一种干燥的坏死形式，使软组织木乃伊化。除了动脉粥样硬化性 PAD 外，还可以在糖尿病患者、血管炎（如 Buerger 病和雷诺氏现象）或终末期肾病情况下的钙化反应患者中观察到该功能5，6。
已经开发了几种临床前模型来研究PAD / CLTI的发病机制并测试潜在治疗方法的疗效，其中最常见的仍然是小鼠后肢缺血。诱导小鼠后肢缺血通常是通过阻塞髂动脉或股动脉的血流来完成的，通过缝合结扎，电凝或其他收缩所需血管的方法7。这些技术大大减少了后肢的灌注，并刺激大腿和小腿肌肉的新生血管形成。然而，小鼠菌株对缺血性损伤的敏感性存在明显的应变性差异，部分原因是侧支分布的解剖学差异8，9。例如，C57BL / 6小鼠对后肢缺血相对耐药，显示肢体功能降低，但通常没有证据表明脚垫中有坏疽。另一方面，BALB / c小鼠从缺血中恢复的能力天生较差，通常在单独股动脉结扎后发生足部或小腿的自动截肢。这种对缺血的严重反应会缩小治疗窗口，并排除对肢体再灌注和功能进行纵向评估。有趣的是，位于小鼠7号染色体上的单个数量性状位点的遗传差异与C57BL / 6和BALB / c小鼠对组织坏死和肢体再灌注的这些差异易感性有关10。
与C57BL / 6和BALB / c菌株相比，FVB小鼠对单独股动脉结扎表现出中间但不一致的反应。一些动物以黑色缺血性指甲或木乃伊手指的形式出现脚垫坏疽，而另一些动物则没有任何明显的缺血迹象11。同时给予Nω-硝基-L-精氨酸甲酯盐酸盐（L-NAME），一种一氧化氮合酶（NOS）抑制剂12，可防止代偿性血管扩张机制，并进一步增加后肢组织中的氧化应激。结合股动脉结扎或凝血，这种方法在FVB小鼠中持续产生足垫组织损失，类似于CLTI的萎缩性变化，但很少进展为肢体自动截肢11。氧化应激是PAD / CLTI的标志之一，并通过内皮功能障碍和一氧化氮（NO）生物利用度降低来传播13，14。NO 是一种多能分子，通常对动脉和毛细血管血流、血小板粘附和聚集以及白细胞募集和活化发挥有益作用13。NOS水平的降低也被证明可以激活血管紧张素转换酶，从而诱导氧化应激并加速动脉粥样硬化的进展15。
一旦建立了后肢缺血的模型，还需要监测随后的肢体再灌注和任何潜在治疗的治疗效果。在提出的小鼠坏疽模型中，可以首先使用Faber评分来量化组织损失的程度，以评估足部的毛坯外观（0：正常，1-5：指甲脱落，其中评分代表受影响的指甲数量，6-10：手指萎缩，其中分数代表受影响的手指数量，11-12：部分和完全足部萎缩， 分别）9.然后通常使用LDPI进行后肢灌注的定量测量，LDPI依赖于激光和红细胞之间的多普勒相互作用来指示感兴趣区域的像素水平灌注（ROI）16。虽然这种技术是定量的，非侵入性的，并且是重复测量的理想选择，但它不能提供后肢脉管系统的颗粒解剖细节16。其他成像方式，如显微计算机断层扫描 （micro-CT）、磁共振血管造影 （MRA） 和 X 射线显微血管造影，要么成本高昂，需要复杂的仪器，要么在技术上具有挑战性16。2008年，Li等人描述了一种用亲脂性碳青染料DiI17标记视网膜内血管的技术。DiI掺入内皮细胞中，并通过直接扩散，染色血管膜结构，如血管生成芽和假足突17，18。由于其直接递送到内皮细胞和染料的高度荧光性质，该过程提供了强烈而持久的血管标记。2012年，Boden等人 通过 股动脉结扎后收获的大腿内收肌的全贴片成像，将DiI灌注技术应用于小鼠后肢缺血模型19。
目前的方法为评估后肢缺血和基于基因或细胞的治疗反应的新生血管形成提供了一种相对便宜且技术上可行的方法。在进一步的改编中，该协议描述了DiI灌注的应用，以高分辨率和3D在后肢坏疽的小鼠模型中对脚垫脉管系统进行成像。
Protocol
Representative Results
Discussion
虽然小鼠后肢缺血是研究PAD和CLTI新生血管形成的最广泛使用的临床前模型，但缺血严重程度和恢复程度存在显着差异，具体取决于所使用的特定小鼠品系以及动脉破坏的部位，数量和方法。股动脉结扎和L-NAME的IP给药相结合可以可靠地诱导FVB小鼠的后肢坏疽11。相同的治疗导致C57BL / 6小鼠的后肢缺血而没有组织损失，而在BALB / c小鼠中，足部或腿部的自动截肢可以仅由股动脉结扎…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了美国国立卫生研究院对Z-J L和OC V的资助[R01HL149452和VITA（NHLBl-CSB-HV-2017-01-JS）]的支持。我们还感谢迈阿密大学医学院迈阿密治疗瘫痪项目的显微镜和成像设施提供对其图像分析和处理软件的访问。
Materials
| Binder clips (small) | Office supply store | ||
| Buprenorphine (sustained-release) | |||
| Butterfly needle (25 G with Luer-Lok) | VWR | 10148-584 | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica | TCS SP5 | |
| DiI (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate) | Invitrogen | D282 | |
| Electrocautery device | Gemini Cautery System | 5917 | |
| Ethanol (100%) | VWR | 89370-084 | |
| Fiji (ImageJ) software | NIH | Used version 2.1.0. Free download, no license required. | |
| Foam biopsy pads | Fisher Scientific | 22-038-221 | |
| Formalin (neutral buffered, 10%) | VWR | 89370-094 | |
| FVB mice | Jackson Laboratory | 001800 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | Used version 2.1.0. |
| HCl (1 M) | Sigma-Aldrich | 13-1700 | |
| Imaris software | Oxford Instruments | Used version 9.6.0. | |
| Isoflurane | Pivetal | NDC 46066-755-04 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Ketamine | |||
| L-NAME (Nω-Nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride) | Sigma-Aldrich | N5751 | |
| Laser Doppler perfusion imager | MoorLDI | moorLDI2-HIR | Used moorLDI V5 software. |
| Microscope slides (25 x 75 x 1 mm) | VWR | 48311-703 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S8282 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S8263 | |
| Needles (27 G) | BD | 305109 | |
| Povidone-iodine swabstick (10%) | Medline | MDS093901ZZ | |
| Surgical instruments | Roboz Surgical | Fine forceps, needle driver, spring scissors, and hemostat are recommended. | |
| Suture (5-0 absorbable) | DemeTECH | G275017B0P | |
| Syringes (10 mL) | BD | 305482 | |
| Three-way stopcocks | Cole-Parmer | 19406-49 | |
| Vascular Analysis Plugin | Free download, no license required. See reference: Elfarnawany (2015). | ||
| Xylazine |
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