Il presente protocollo descrive un modello unico e clinicamente rilevante di arteriopatia periferica che combina l’elettrocoagulazione dell’arteria femorale e venosa con la somministrazione di un inibitore dell’ossido nitrico sintasi per indurre la cancrena degli arti posteriori nei topi FVB. La perfusione intracardiaca di DiI viene quindi utilizzata per l’imaging tridimensionale ad alta risoluzione della vascolarizzazione del footpad.
La malattia arteriosa periferica (PAD) è una causa significativa di morbilità derivante dall’esposizione cronica a fattori di rischio aterosclerotici. I pazienti affetti dalla sua forma più grave, l’ischemia cronica che minaccia gli arti (CLTI), affrontano notevoli menomazioni nella vita quotidiana, tra cui dolore cronico, distanza a piedi limitata senza dolore e ferite non cicatrizzanti. Modelli preclinici sono stati sviluppati in vari animali per studiare la PAD, ma l’ischemia degli arti posteriori del topo rimane la più utilizzata. Ci possono essere variazioni significative nella risposta all’insulto ischemico in questi modelli a seconda del ceppo di topo utilizzato e del sito, del numero e dei mezzi di interruzione arteriosa. Questo protocollo descrive un metodo unico che combina l’elettrocoagulazione dell’arteria femorale e della vena con la somministrazione di un inibitore dell’ossido nitrico sintasi (NOS) per indurre in modo affidabile la cancrena del footpad nei topi Friend Virus B (FVB) che assomiglia alla perdita di tessuto di CLTI. Mentre i mezzi tradizionali di valutazione della riperfusione come l’imaging laser doppler perfusione (LDPI) sono ancora raccomandati, la perfusione intracardiaca del colorante lipofilo 1,1′-diottadecil-3,3,3′,3′-tetrametilindocarbocianina perclorato (DiI) viene utilizzata per etichettare la vascolarizzazione. La successiva microscopia a scansione laser confocale a montaggio intero consente la ricostruzione tridimensionale (3D) ad alta risoluzione delle reti vascolari footpad che integra i mezzi tradizionali di valutazione della riperfusione nei modelli di ischemia degli arti posteriori.
La malattia arteriosa periferica (PAD), caratterizzata da un ridotto flusso sanguigno alle estremità a causa dell’aterosclerosi, colpisce 6,5 milioni di persone negli Stati Uniti e 200 milioni di persone in tutto il mondo1. I pazienti con PAD sperimentano una ridotta funzionalità degli arti e qualità della vita, e quelli con CLTI, la forma più grave di PAD, sono ad aumentato rischio di amputazione e morte con un tasso di mortalità a 5 anni vicino al 50%2. Nella pratica clinica, i pazienti con indici caviglia-brachiali (ABI) <0,9 sono considerati affetti da PAD e quelli con ABI < 0,4 associati a dolore a riposo o perdita di tessuto come affetti da CLTI3. I sintomi variano tra i pazienti con ABI simili a seconda dell’attività quotidiana, della tolleranza muscolare all’ischemia, delle variazioni anatomiche e delle differenze nello sviluppo collaterale4. La cancrena delle dita e degli arti è la manifestazione più grave di tutte le malattie occlusive vascolari che provocano CLTI. È una forma di necrosi secca che mummifica i tessuti molli. Oltre alla PAD aterosclerotica, può essere osservata anche in pazienti con diabete, vasculitidi come la malattia di Buerger e il fenomeno di Raynaud, o calcifilassi nel contesto della malattia renale allo stadio terminale5,6.
Sono stati sviluppati diversi modelli preclinici per studiare la patogenesi della PAD/CLTI e testare l’efficacia di potenziali trattamenti, il più comune dei quali rimane l’ischemia degli arti posteriori del topo. L’induzione dell’ischemia del tronco posteriore nei topi è tipicamente realizzata dall’ostruzione del flusso sanguigno dalle arterie iliache o femorali, sia mediante legatura di sutura, elettrocoagulazione o altri mezzi per restringere il vaso desiderato7. Queste tecniche riducono drasticamente la perfusione agli arti posteriori e stimolano la neovascolarizzazione nei muscoli della coscia e del polpaccio. Tuttavia, esistono differenze essenziali murine dipendenti dal ceppo nella sensibilità all’insulto ischemico, in parte dovute a differenze anatomiche nella distribuzione delle garanzie8,9. Ad esempio, i topi C57BL/6 sono relativamente resistenti all’ischemia degli arti posteriori, dimostrando una ridotta funzionalità degli arti ma generalmente nessuna evidenza di cancrena nella pedana. D’altra parte, i topi BALB / c hanno una capacità intrinsecamente scarsa di riprendersi dall’ischemia e in genere sviluppano l’autoamplificazione del piede o della parte inferiore della gamba dopo la sola legatura dell’arteria femorale. Questa grave risposta all’ischemia restringe la finestra terapeutica e può precludere la valutazione longitudinale della riperfusione e della funzione degli arti. È interessante notare che le differenze genetiche in un singolo locus del tratto quantitativo situato sul cromosoma murino 7 sono state implicate in queste suscettibilità differenziali dei topi C57BL/6 e BALB/c alla necrosi tissutale e alla riperfusione degli arti10.
Rispetto ai ceppi C57BL/6 e BALB/c, i topi FVB dimostrano una risposta intermedia ma incoerente alla sola legatura dell’arteria femorale. Alcuni animali sviluppano cancrena sotto forma di unghie ischemiche nere o dita mummificate, altri ancora senza segni evidenti di ischemia11. La somministrazione concomitante di Nω-Nitro-L-arginina estere metilico cloridrato (L-NAME), un inibitore dell’ossido nitrico sintasi (NOS)12, previene i meccanismi vasodilatatori compensatori e aumenta ulteriormente lo stress ossidativo nel tessuto posteriore. In combinazione con la legatura o la coagulazione dell’arteria femorale, questo approccio produce costantemente una perdita di tessuto del footpad nei topi FVB che assomiglia ai cambiamenti atrofici del CLTI, ma raramente progredisce verso l’auto-amputazione degli arti11. Lo stress ossidativo è uno dei tratti distintivi della PAD/CLTI ed è propagato dalla disfunzione endoteliale e dalla diminuita biodisponibilità dell’ossido nitrico (NO)13,14. L’NO è una molecola pluripotente che di solito esercita effetti benefici sul flusso sanguigno arterioso e capillare, sull’adesione e aggregazione piastrinica e sul reclutamento e l’attivazione dei leucociti13. Livelli ridotti di NOS hanno anche dimostrato di attivare l’enzima di conversione dell’angiotensina, che induce stress ossidativo e accelera la progressione dell’aterosclerosi15.
Una volta stabilito un modello di ischemia degli arti posteriori, è necessario monitorare la successiva riperfusione degli arti e l’effetto terapeutico di eventuali trattamenti potenziali. Nel modello di cancrena murina proposto, il grado di perdita di tessuto può essere prima quantificato utilizzando il punteggio Faber per valutare l’aspetto lordo del piede (0: normale, 1-5: perdita di unghie dove il punteggio rappresenta il numero di unghie colpite, 6-10: atrofia delle dita dove il punteggio rappresenta il numero di cifre colpite, 11-12: atrofia parziale e completa del piede, rispettivamente)9. Le misurazioni quantitative della perfusione degli arti posteriori vengono quindi in genere effettuate utilizzando LDPI, che si basa sulle interazioni Doppler tra luce laser e globuli rossi per indicare la perfusione a livello di pixel in una regione di interesse (ROI)16. Sebbene questa tecnica sia quantitativa, non invasiva e ideale per misurazioni ripetute, non fornisce dettagli anatomici granulari della vascolarizzazione degli arti posteriori16. Altre modalità di imaging, come la tomografia micro-computerizzata (micro-CT), l’angiografia a risonanza magnetica (MRA) e la microangiografia a raggi X, si rivelano costose, richiedono una strumentazione sofisticata o altrimenti tecnicamente impegnative16. Nel 2008, Li et al. hanno descritto una tecnica per etichettare i vasi sanguigni all’interno della retina con il colorante lipofilo di carbocianina DiI17. DiI incorpora nelle cellule endoteliali e, per diffusione diretta, colora le strutture della membrana vascolare come germogli angiogenici e processi pseudopodali17,18. Grazie alla sua consegna diretta nelle cellule endoteliali e alla natura altamente fluorescente del colorante, questa procedura fornisce un’etichettatura intensa e duratura dei vasi sanguigni. Nel 2012, Boden et al. hanno adattato la tecnica della perfusione DiI al modello di ischemia dell’arto posteriore murino tramite imaging a montaggio intero dei muscoli adduttori della coscia raccolti dopo la legatura dell’arteria femorale19.
Il metodo attuale fornisce un modo relativamente economico e tecnicamente fattibile per valutare la neovascolarizzazione in risposta all’ischemia degli arti posteriori e alle terapie basate su geni o cellule. In un ulteriore adattamento, questo protocollo descrive l’applicazione della perfusione DiI per visualizzare la vascolarizzazione del footpad in alta risoluzione e 3D in un modello murino di cancrena posteriore.
Mentre l’ischemia del tronco posteriore del topo è il modello preclinico più utilizzato per studiare la neovascolarizzazione in PAD e CLTI, vi è una variazione significativa nella gravità e nel recupero dell’ischemia a seconda del ceppo murino specifico utilizzato e del sito, del numero e del metodo di interruzione arteriosa. La combinazione di legatura dell’arteria femorale e somministrazione IP di L-NAME può indurre in modo affidabile la cancrena degli arti posteriori nei topi FVB11. Lo ste…
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni a Z-J L e OC V dal National Institutes of Health [R01HL149452 e VITA (NHLBl-CSB-HV-2017-01-JS)]. Ringraziamo anche la Microscopy and Imaging Facility del Miami Project to Cure Paralysis presso la University of Miami School of Medicine per aver fornito l’accesso al loro software di analisi ed elaborazione delle immagini.
Binder clips (small) | Office supply store | ||
Buprenorphine (sustained-release) | |||
Butterfly needle (25 G with Luer-Lok) | VWR | 10148-584 | |
Confocal laser scanning microscope | Leica | TCS SP5 | |
DiI (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate) | Invitrogen | D282 | |
Electrocautery device | Gemini Cautery System | 5917 | |
Ethanol (100%) | VWR | 89370-084 | |
Fiji (ImageJ) software | NIH | Used version 2.1.0. Free download, no license required. | |
Foam biopsy pads | Fisher Scientific | 22-038-221 | |
Formalin (neutral buffered, 10%) | VWR | 89370-094 | |
FVB mice | Jackson Laboratory | 001800 | |
Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | Used version 2.1.0. |
HCl (1 M) | Sigma-Aldrich | 13-1700 | |
Imaris software | Oxford Instruments | Used version 9.6.0. | |
Isoflurane | Pivetal | NDC 46066-755-04 | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
Ketamine | |||
L-NAME (Nω-Nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride) | Sigma-Aldrich | N5751 | |
Laser Doppler perfusion imager | MoorLDI | moorLDI2-HIR | Used moorLDI V5 software. |
Microscope slides (25 x 75 x 1 mm) | VWR | 48311-703 | |
Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S8282 | |
NaOH | Sigma-Aldrich | S8263 | |
Needles (27 G) | BD | 305109 | |
Povidone-iodine swabstick (10%) | Medline | MDS093901ZZ | |
Surgical instruments | Roboz Surgical | Fine forceps, needle driver, spring scissors, and hemostat are recommended. | |
Suture (5-0 absorbable) | DemeTECH | G275017B0P | |
Syringes (10 mL) | BD | 305482 | |
Three-way stopcocks | Cole-Parmer | 19406-49 | |
Vascular Analysis Plugin | Free download, no license required. See reference: Elfarnawany (2015). | ||
Xylazine |