Murine Hindlimb Gangrene 모델에서 발판 혈관 구조의 고해상도 입체 이미징
Summary
본 프로토콜은 FVB 마우스에서 뒷다리 괴저(hindlimb gangrene)를 유도하기 위해 대퇴골 동맥 및 정맥 전기응고와 산화질소 합성효소 억제제의 투여를 결합한 말초 동맥 질환의 독특하고 임상적으로 관련된 모델을 기술한다. 심장 내 DiI 관류는 풋패드 혈관 구조의 고해상도, 입체 영상화에 사용됩니다.
Abstract
말초 동맥 질환 (PAD)은 죽상 경화성 위험 인자에 대한 만성 노출로 인한 이환의 중요한 원인입니다. 가장 심한 형태, 만성 사지를 위협하는 허혈 (CLTI)으로 고통받는 환자는 만성 통증, 통증이없는 제한된 도보 거리 및 치유되지 않는 상처를 포함하여 일상 생활에 상당한 장애에 직면합니다. 전임상 모델은 PAD를 연구하기 위해 다양한 동물에서 개발되었지만 마우스 뒷다리 허혈은 여전히 가장 널리 사용되고 있습니다. 이들 모델에서 허혈성 모욕에 대한 반응에서 상당한 변동이 있을 수 있는데, 사용된 마우스 균주 및 동맥 파괴의 부위, 수 및 수단에 의존한다. 이 프로토콜은 CLTI의 조직 손실과 유사한 프렌드 바이러스 B (FVB) 마우스에서 발판 괴괴를 안정적으로 유도하기 위해 대퇴 동맥 및 정맥 전기 응고를 산화 질소 신타제 (NOS) 억제제의 투여와 결합하는 독특한 방법을 설명합니다. 레이저 도플러 관류 영상 (LDPI)과 같은 재관류를 평가하는 전통적인 수단이 여전히 권장되지만, 친유성 염료 1,1′-디옥타데실-3,3,3′,3′-테트라메틸인도카르보시아닌 과염소산염 (DiI)의 심장 내 관류는 혈관 구조를 라벨링하는 데 사용됩니다. 후속 전체 마운트 공초점 레이저 스캐닝 현미경 검사는 뒷다리 허혈 모델에서 재관류를 평가하는 전통적인 수단을 보완하는 풋패드 혈관 네트워크의 고해상도, 3차원(3D) 재구성을 가능하게 합니다.
Introduction
죽상 동맥 경화증으로 인해 사지로의 혈류 감소를 특징으로하는 말초 동맥 질환 (PAD)은 미국에서 6.5 백만 명과 전 세계적으로 2 억 명에게 영향을 미칩니다1. PAD 환자는 사지 기능과 삶의 질이 저하 된 경험을하고, PAD의 가장 심각한 형태 인 CLTI를 가진 환자는 절단 및 사망 위험이 증가하며 5 년 사망률은 50 % 2에 가깝습니다. 임상 실습에서, 발목-상완 지수(ABI) <0.9를 갖는 환자는 PAD를 갖는 것으로 간주되고, ABI <0.4를 갖는 환자는 CLTI3을 갖는 것으로 휴식 통증 또는 조직 손실과 관련된다. 증상은 일상 활동, 허혈에 대한 근육 내성, 해부학 적 변화 및 부수적 인 발달의 차이에 따라 유사한 ABI를 가진 환자간에 다릅니다4. 디지트 및 사지 괴저(Digit and limb gangrene)는 CLTI를 초래하는 모든 혈관 폐쇄성 질환 중 가장 심각한 증상이다. 그것은 연조직을 미라화하는 건조한 괴사의 한 형태입니다. 죽상 경화성 PAD 외에도 당뇨병, Buerger 병 및 Raynaud 현상과 같은 혈관염 또는 말기 신장 질환의 설정에서 calciphylaxis 환자에서도 관찰 될 수 있습니다5,6.
PAD / CLTI의 발병 기전을 연구하고 잠재적 인 치료법의 효능을 테스트하기 위해 몇 가지 전임상 모델이 개발되었으며, 그 중 가장 흔한 것은 마우스 뒷다리 허혈로 남아 있습니다. 마우스에서 뒷다리 허혈을 유도하는 것은 전형적으로 봉합사 결찰, 전기 응고 또는 원하는 혈관을 수축시키는 다른 수단에 의해, 장골 또는 대퇴골 동맥으로부터의 혈류의 방해에 의해 달성된다7. 이 기술은 뒷다리에 대한 관류를 크게 줄이고 허벅지와 종아리 근육의 신생혈관화를 자극합니다. 그러나, 부수적 분포의 해부학적 차이로 인해 허혈성 모욕에 대한 민감도에 필수적인 뮤린 균주-의존적 차이가 부분적으로 존재한다8,9. 예를 들어, C57BL/6 마우스는 뒷다리 허혈에 상대적으로 내성이 있어 사지 기능이 감소하지만 일반적으로 발판에서 괴저에 대한 증거는 없다. 반면에, BALB/c 마우스는 허혈로부터 회복할 수 있는 능력이 본질적으로 열악하며, 전형적으로 대퇴골 동맥 결찰 단독 후 발 또는 하부 다리의 자동 절단을 일으킨다. 허혈에 대한이 심한 반응은 치료 창을 좁히고 사지 재관류 및 기능에 대한 종단 평가를 배제 할 수 있습니다. 흥미롭게도, 뮤린 염색체 7에 위치한 단일 정량적 형질 유전자좌의 유전적 차이는 조직 괴사 및 사지 재관류에 대한 C57BL/6 및 BALB/c 마우스의 이러한 차별적 감수성에 연루되어 있다10.
C57BL/6 및 BALB/c 균주와 비교하여, FVB 마우스는 대퇴골 동맥 결찰 단독에 대해 중간이지만 일관성 없는 반응을 보인다. 일부 동물은 검은 허혈성 손톱이나 미라화 된 숫자의 형태로 발판 괴저가 발생하지만 허혈의 명백한 징후가없는 동물도 있습니다11. 산화질소 합성효소(NOS) 억제제12인 Nω-Nitro-L-아르기닌 메틸 에스테르 염산염(L-NAME)의 병용 투여는 보상 혈관 확장 기작을 예방하고 뒷다리 조직의 산화 스트레스를 더욱 증가시킨다. 대퇴골 동맥 결찰 또는 응고와 함께, 이 접근법은 CLTI의 위축성 변화와 유사한 FVB 마우스에서 지속적으로 풋패드 조직 손실을 발생시키지만, 사지 자동 절단으로 거의 진행되지 않는다11. 산화 스트레스는 PAD / CLTI의 특징 중 하나이며 내피 기능 장애와 산화 질소 (NO) 13,14의 생체 이용률 감소에 의해 전파됩니다. NO는 일반적으로 동맥 및 모세관 혈류, 혈소판 부착 및 응집, 백혈구 모집 및 활성화에 유익한 효과를 발휘하는 다능성 분자이다13. NOS의 감소된 수준은 또한 산화 스트레스를 유도하고 죽상동맥경화증의 진행을 가속화하는 안지오텐신 전환 효소를 활성화시키는 것으로 나타났다15.
일단 뒷다리 허혈의 모델이 확립되면, 후속 사지 재관류 및 잠재적 인 치료법의 치료 효과를 모니터링하는 것도 필요합니다. 제안 된 뮤린 괴저 모델에서, 조직 손실의 정도는 먼저 Faber 점수를 사용하여 발의 총 모양을 평가하기 위해 정량화 될 수 있습니다 (0 : 정상, 1-5 : 점수가 영향을받는 손톱의 수를 나타내는 손톱 손실, 6-10 : 점수가 영향을받는 숫자의 수를 나타내는 숫자의 위축, 11-12 : 부분적이고 완전한 발 위축, 각각)9. 그런 다음 뒷다리 관류의 정량적 측정은 일반적으로 LDPI를 사용하여 이루어지며, LDPI는 레이저 광과 적혈구 사이의 도플러 상호 작용에 의존하여 관심 영역 (ROI)16에서 픽셀 수준의 관류를 나타냅니다. 이 기술은 양적, 비침습적, 반복적 인 측정에 이상적이지만 뒷다리 혈관 구조의 세분화 된 해부학 적 세부 사항을 제공하지는 않습니다16. 마이크로 컴퓨터 단층 촬영 (micro-CT), 자기 공명 혈관 조영술 (MRA) 및 X 선 미세 혈관 조영술과 같은 다른 이미징 양식은 비용이 많이 들고 정교한 계측이 필요하거나 기술적으로 어려운 것으로 입증되었습니다16. 2008년에, Li et al.은 친유성 카르보시아닌 염료 DiI17로 망막 내 혈관을 표지하는 기술을 기술하였다. DiI는 내피 세포로 통합되고, 직접 확산에 의해, 혈관신생 새싹채소 및 유사 포드 과정과 같은 혈관막 구조를 염색한다17,18. 내피 세포로의 직접 전달과 염료의 형광성이 높기 때문에이 절차는 혈관의 강렬하고 오래 지속되는 라벨링을 제공합니다. 2012년에, Boden et al.은 대퇴골 동맥 결찰 후 수확된 허벅지 부가물 근육의 전체 탑재 영상화를 통해 뮤린 뒷다리 허혈 모델에 DiI 관류 기술을 적용하였다19.
현재의 방법은 뒷다리 허혈 및 유전자 또는 세포 기반 치료제에 반응하여 신생혈관화를 평가하기 위한 비교적 저렴하고 기술적으로 실현 가능한 방법을 제공한다. 추가의 적응에서, 이 프로토콜은 뒷다리 괴저의 뮤린 모델에서 발판 혈관구조를 고해상도로 그리고 3D로 이미지화하기 위한 DiI 관류의 적용을 기술한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
마우스 뒷다리 허혈은 PAD 및 CLTI에서 신생혈관화를 연구하기 위해 가장 널리 사용되는 전임상 모델이지만, 사용된 특정 마우스 균주 및 동맥 파괴의 부위, 수 및 방법에 따라 허혈 중증도 및 회복에 상당한 차이가 있다. 대퇴골 동맥 결찰 및 L-NAME의 IP 투여의 조합은 FVB 마우스11에서 뒷다리 괴저(hindlimb gangrene)를 확실하게 유도할 수 있다. 동일한 치료로 C57BL/6 마우스에서 조직 손?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업은 국립 보건원 (R01HL149452 및 VITA (NHLBl-CSB-HV-2017-01-JS))의 Z-J L 및 OC V에 대한 보조금으로 지원되었습니다. 우리는 또한 마이애미 의과 대학의 마비를 치료하기위한 마이애미 프로젝트의 현미경 검사 및 이미징 시설에 감사 드리며 이미지 분석 및 처리 소프트웨어에 대한 액세스를 제공합니다.
Materials
| Binder clips (small) | Office supply store | ||
| Buprenorphine (sustained-release) | |||
| Butterfly needle (25 G with Luer-Lok) | VWR | 10148-584 | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica | TCS SP5 | |
| DiI (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate) | Invitrogen | D282 | |
| Electrocautery device | Gemini Cautery System | 5917 | |
| Ethanol (100%) | VWR | 89370-084 | |
| Fiji (ImageJ) software | NIH | Used version 2.1.0. Free download, no license required. | |
| Foam biopsy pads | Fisher Scientific | 22-038-221 | |
| Formalin (neutral buffered, 10%) | VWR | 89370-094 | |
| FVB mice | Jackson Laboratory | 001800 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | Used version 2.1.0. |
| HCl (1 M) | Sigma-Aldrich | 13-1700 | |
| Imaris software | Oxford Instruments | Used version 9.6.0. | |
| Isoflurane | Pivetal | NDC 46066-755-04 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Ketamine | |||
| L-NAME (Nω-Nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride) | Sigma-Aldrich | N5751 | |
| Laser Doppler perfusion imager | MoorLDI | moorLDI2-HIR | Used moorLDI V5 software. |
| Microscope slides (25 x 75 x 1 mm) | VWR | 48311-703 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S8282 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S8263 | |
| Needles (27 G) | BD | 305109 | |
| Povidone-iodine swabstick (10%) | Medline | MDS093901ZZ | |
| Surgical instruments | Roboz Surgical | Fine forceps, needle driver, spring scissors, and hemostat are recommended. | |
| Suture (5-0 absorbable) | DemeTECH | G275017B0P | |
| Syringes (10 mL) | BD | 305482 | |
| Three-way stopcocks | Cole-Parmer | 19406-49 | |
| Vascular Analysis Plugin | Free download, no license required. See reference: Elfarnawany (2015). | ||
| Xylazine |
Riferimenti
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