Caracterización de células endoteliales de crecimiento sanguíneo (BOEC) de sangre periférica porcina
Abstract
El endotelio es una estructura dinámica integrada que desempeña un papel importante en muchas funciones fisiológicas como la angiogénesis, la hemostasia, la inflamación y la homeostasis. El endotelio también juega un papel importante en fisiopatologías como la aterosclerosis, la hipertensión y la diabetes. Las células endoteliales forman el revestimiento interno de los vasos sanguíneos y linfáticos y muestran heterogeneidad en estructura y función. Varios grupos han evaluado la funcionalidad de las células endoteliales derivadas de la sangre periférica humana con un enfoque en las células progenitoras endoteliales derivadas de células madre hematopoyéticas o células endoteliales maduras de crecimiento sanguíneo (o células formadoras de colonias endoteliales). Estas células proporcionan un recurso autólogo para la terapéutica y el modelado de enfermedades. Las células xenogénicas pueden proporcionar una fuente alternativa de terapéutica debido a su disponibilidad y homogeneidad logradas mediante el uso de animales genéticamente similares criados en condiciones similares. Por lo tanto, se ha presentado un protocolo robusto para el aislamiento y la expansión de células endoteliales de crecimiento sanguíneo altamente proliferativo de sangre periférica porcina. Estas células se pueden utilizar para numerosas aplicaciones, como ingeniería de tejidos cardiovasculares, terapia celular, modelado de enfermedades, detección de fármacos, estudio de la biología de las células endoteliales y cocultivos in vitro para investigar las respuestas inflamatorias y de coagulación en el xenotrasplante.
Introduction
El endotelio es una estructura altamente compleja y dinámica y un componente vital de la pared vascular. Recubre la superficie interna de los vasos sanguíneos para proporcionar una interfaz física entre la sangre circulante y los tejidos circundantes. Se sabe que esta estructura heterogénea realiza diversas funciones como angiogénesis, inflamación, vasoregulación y hemostasia 1,2,3,4. Las células endoteliales de la vena umbilical humana son un tipo de célula ampliamente estudiado para evaluar la funcionalidad de las células endoteliales. Sin embargo, la variabilidad del lote específica del paciente, el fenotipo inconsistente y la eficiencia mínima de división sugieren la necesidad de determinar una fuente celular que pueda mejorar todas estas características5.
Obtener una población homogénea de células endoteliales primarias puede ser técnicamente difícil, y las células endoteliales primarias no poseen una alta capacidad proliferativa6. Por lo tanto, para estudiar la regeneración vascular y evaluar los procesos fisiopatológicos, varios grupos han tratado de obtener y evaluar diferentes tipos de células endoteliales derivadas de sangre periférica, por ejemplo, células progenitoras endoteliales (CPE) o células endoteliales de crecimiento sanguíneo (BOEC)6,7,8,9 . Las EPC tempranas en forma de huso se originan a partir de células madre hematopoyéticas (HSC) y tienen una potencia de crecimiento limitada y una capacidad angiogénica limitada para producir células endoteliales maduras. Además, se parecen mucho a los monocitos inflamatorios. Además, su capacidad para diferenciarse aún más en células endoteliales funcionales, proliferantes y maduras sigue siendo discutible 6,7,9,10. El cultivo continuo de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) puede dar lugar a una población secundaria de células conocidas como EPC de crecimiento tardío, BOEC o células formadoras de colonias endoteliales (ECFC)6,7,9,10. Medina et al. en 2018, reconocieron las limitaciones de los EPC, la ambigüedad de su nomenclatura, junto con una falta general de concordancia con muchos tipos de células distintas agrupadas continuamente bajo EPC11. En contraste, los BOEC han sido reconocidos por su papel en la reparación vascular, la salud y la enfermedad, y la terapia celular. El estudio adicional y el uso terapéutico de estas células se basarán en protocolos para derivar consistentemente estos tipos de células a partir de células progenitoras circulantes.
Las células primarias como los BOEC pueden ser utilizadas como sustituto para obtener células endoteliales maduras altamente proliferativas6. Los BOEC son fenotípicamente distintos de los EPC tempranos y exhiben características endoteliales típicas, como la morfología de los adoquines y la expresión de uniones adherentes y caveolas12. El perfil genético de Hebbel et al.13,14,15 encontró que los BOEC o ECFC son las verdaderas células endoteliales, ya que promueven la formación de vasos microvasculares y grandes. Así, los BOEC pueden ser utilizados como herramienta para evaluar procesos fisiopatológicos y variación genética16. También se consideran una excelente fuente celular para la terapia celular para la regeneración vascular17. Por lo tanto, un protocolo estandarizado para derivar consistentemente estas células altamente proliferativas es esencial.
Mientras que los BOEC proporcionan una herramienta poderosa para estudiar la variación fisiopatológica y genética humana, una fuente más homogénea de BOEC puede proporcionar resultados experimentales y terapéuticos más sólidos y confiables. Se puede lograr una homogeneidad superior utilizando fuentes celulares xenogénicas derivadas de animales genéticamente similares criados en condiciones similares18. Si bien las fuentes de células xenogénicas son propensas a provocar una respuesta inmune del huésped, se están desarrollando estrategias de inmunomodulación con el objetivo de generar animales y productos animales inmunocompatibles, incluidas las células. Los cerdos, en particular, son una fuente abundante de sangre periférica y se usan comúnmente para estudiar dispositivos médicos y otras terapias debido a las similitudes anatómicas y fisiológicas con los humanos. Por lo tanto, este estudio refina el protocolo para el aislamiento y la expansión de BOEC altamente proliferativos de sangre periférica porcina. El protocolo detallado a continuación es un método sencillo y confiable para obtener una gran cantidad de BOEC a partir de un volumen relativamente pequeño de sangre. Los cultivos se pueden expandir a través de varios pasajes para generar millones de células a partir de una sola muestra de sangre.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los BOEC son una poderosa herramienta que puede ser utilizada en diversos enfoques científicos y terapéuticos 7,8,16. Los BOEC se han utilizado para analizar la expresión génica de la CE para dilucidar los factores clave responsables del desarrollo de enfermedades vasculares y cáncer 5,19,20,21. L…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean reconocer la financiación de NIH / NHLBI R00 HL129068.
Materials
| 19 G needle | Covidien | 1188818112 | |
| 50 mL conical tubes | Corning | 352098 | |
| 6 well plate | BD Falcon | 353046 | |
| 60 mL syringes | Covidien | 8881560125 | |
| Ammonium chloride solution (0.8%) | Stemcell Technologies | 07850 | |
| Antibiotic/antimycotic solution (100x) | Gibco | 15240-062 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75-253-839 | |
| EGM-2 culture medium | Lonza Walkersville | CC-3162 | |
| Extension tube | Hanna Pharmaceutical Supply Co. | 03382C6227 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Atlas Biologicals | F-0500-A | |
| Ficoll-Paque 1077 | Cytiva | 17144003 | Density gradient solution |
| Heparin sodium injection (1,000 units/mL) | Pfizer | 00069-0058-01 | |
| Human plasma fibronectin | Gibco | 33016-015 | |
| Ice | N/A | N/A | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-023 | |
| Pipette set | Eppendorf | 2231300004 | |
| Sterile water | Gibco | 15230-162 | |
| Thin pipette | Celltreat Scientific | 229280 |
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