Denne protokol skitserer en metode til effektivt at udtrække levende nematoder fra naturlige substrater i marken.
Ud over at være robuste eksperimentelle modelorganismer er Caenorhabditis elegans og dets slægtninge også rigtige dyr, der lever i naturen. Undersøgelser af vilde nematoder i deres naturlige miljøer er værdifulde for at forstå mange aspekter af biologi, herunder de selektive regimer, hvor karakteristiske genomiske og fænotypiske tegn udvikler sig, det genetiske grundlag for kompleks træk variation, og den naturlige genetiske mangfoldighed grundlæggende for alle dyrepopulationer. Dette manuskript beskriver en enkel og effektiv metode til udvinding af nematoder fra deres naturlige substrater, herunder rådnende frugter, blomster, svampe, bladkuld og jord. Baermann tragtmetoden, en klassisk nematologiteknik, isolerer selektivt aktive nematoder fra deres substrater. Fordi det genvinder næsten alle aktive orme fra prøven, giver Baermann-tragtteknikken mulighed for genopretning af sjældne og langsomt voksende genotyper, der forekommer sammen med rigelige og hurtigt voksende genotyper, som kan gå glip af i ekstraktionsmetoder, der involverer flere generationer af reproduktion. Teknikken er også velegnet til at løse metagenetiske, befolkning-genetiske og økologiske spørgsmål. Det fanger hele befolkningen i en prøve samtidigt, hvilket giver et upartisk billede af den naturlige fordeling af aldre, køn og genotyper. Protokollen giver mulighed for implementering i stor skala i marken, hurtigt konvertere substrater til orm plader, og forfatterne har valideret det gennem feltarbejde på flere kontinenter.
Værdifulde biologiske indsigter er ved at opstå som forskere, der studerer C. elegans i laboratoriet udvide deres fokus til C. elegans og relaterede rhabditid nematoder i naturen. Undersøgelser af vilde nematoder placerer gener og genomer i deres naturlige sammenhæng, afslører funktioner potentielt tilsløret af laboratorieforhold1,2,3,4,5. Disse undersøgelser genererer indsigt i forudsætningen for evolution selv, genetisk variation6,7,8,9,10. Den naturlige genetiske variation fanget af vilde prøver giver også indhug i det genetiske grundlag for mange komplekse træk11,12,13.
Når man designer undersøgelser, der kræver isolering af naturlige populationer af nematoder, især når de udfører fjernt feltarbejde, kommer praktiske overvejelser i foræf for øje. Denne protokol har til formål at isolere hele populationer af aktive nematoder rent ud fra agn eller vilde substrater. Metoden er velegnet til udvinding af fritlevende rhabditid og diplogasterid nematoder, herunder Caenorhabditis, Oscheius og Pristionchus.
Der er mange teknikker til isolering nematoder fra deres substrater14,15. Den mest grundlæggende tilgang er at placere substratet direkte på en nematode-medium plade, plukke dyr, når de kryber ud8,15. Denne metode kræver store mængder tid og arbejdskraft, hvis målet er at isolere alle nematoder fra en prøve. Mere sofistikerede teknikker drage fordel af dyrenes vægt, størrelse, mobilitet, eller en kombination af disse14. Hver metode har sine fordele og ulemper med hensyn til opsætning og gennemløb. De adskiller sig også i deres prøveudtagningsbias og kan vælge for visse nematoder, hvis dyrene i prøven varierer langs aksen i metodens separationsprincip.
Baermann-tragtmetoden blev først beskrevet i 1917 af den hollandske læge G.K.T.F. Baermann, som opfandt enheden på Java, mens han studerede jordlevende nematoder, herunder den parasitære hageorm16. Baermann-tragten fungerer ud fra mobilitetsprincippet. Substratet placeres i en tragt foret med en klud eller papirfilter (en “Kimwipe” bruges til denne undersøgelse, kaldet “fnugfri tørning” i den aktuelle protokol) og forseglet lukket i bunden. Tragten fyldes derefter med vand og nedsænkes prøven, mens filteret adskiller den fra den forseglede stikkontakt. Aktive nematoder i prøven frigiver sig selv i vandet og svømmer gennem filteret og sætter sig til sidst i bunden af tragten. Tragtudtaget åbnes, og en dråbe nematoder udstødes på en plade (figur 1).
Figur 1: Resumé af Baermann tragt teknik. (A) Indsamling af en bakterie-rige prøve fra et sted af interesse. B) Nedsænkning af prøven i en Baermann-tragt og venter på, at orme vrider sig ud og synker. (C) Frigivelse af en enkelt dråbe fra tragten. (D) Flytning enkelt hermafroditter eller parrede hunner til separate plader. Illustration skabt af Ramin Rahni. Klik her for at se en større version af dette tal.
Baermann-tragten fungerer ikke for enhver form for nematode (se diskussionsafsnittet for specifikke alternativer) og er bedst egnet til dem, der er aktive former i caenorhabditis eller mindre14. Men hvis en undersøgelse kan bruge Baermann tragten, er der mange fordele. Metoden er praktisk i marken, der kræver begrænset opsætning, hands-on tid og omkostninger. Forskeren efterlades med en ren prøve uden obstruktion af substratet på pladen, hvilket gør det nemt at plukke. Ved hjælp af et filter forhindrer også forurening af pladen med insektlarver eller mider, som tygger plader eller bytte på nematoder i prøven. Vigtigst er det, at Baermann-tragten effektivt udvinder næsten hele befolkningen fra substratet14, hvilket kan være påkrævet afhængigt af undersøgelsens design. For eksempel, forskere interesseret i at tælle vilde populationer fase eller kønsfordeling, finde langsomt voksende eller sjældne genotyper, eller prøveudtagning nematoder ikke tiltrukket af OP50 kan drage fordel af denne metode. Dette er hensigtsmæssigt for forskere, der studerer økologiske17, population genetik18, eller metagenetiske19 spørgsmål som prøveudtagning ordningen tager et øjebliksbillede af befolkningen på prøveudtagning tid.
Det foreliggende manuskript beskriver en komplet protokol for isolering af populationer af nematoder ved hjælp af Baermann tragten og oprettelse af isofemale og isohermafrodit linjer i marken, ved hjælp af udstyr valgt til nem transport. For forskere, der udfører feltarbejde i nærheden af deres laboratorier, kan mange af disse trin udelades eller forenkles.
Det centrale princip i denne metode er, at nematoder vil passere gennem vævet nedsænket i vand, mens deres substrat og større hvirvelløse forurenende stoffer ikke vil. De kritiske trin i protokollen er (1) indsamling af et passende substrat, (2) nedsænkning af substratet, indpakket i et filtreringsmateriale, i vand, (3) indsamling orme, der har passeret gennem filteret og sunket til bunden af vandet, og (4) isolere individuelle orme til at skabe isofemale eller isohermafrodit linjer. Alle andre dele af metoden kan ændres efter behov i henhold til de tilgængelige ressourcer, substraternes art eller fieldwork-målene. Nogle ændringer værd at overveje er som følger.
Baiting ormene ved at plante frugt
Hvis der ikke er en rigelig forsyning af bakterierige rådnende materiale, der findes på marken, kan man ønske at bringe en prøve, såsom et stykke æble eller tomat, til at forlade at rådne. Pin agn ned godt med et par indsatser, så større dyr ikke fjerner dem, og så det nemt kan findes senere til indsamling. Undgå direkte sollys, hvor agn kan tørre, før den rådner.
Konstruktion tragt apparat ud af uanset materialer er tilgængelige
Enhver struktur med huller, der er store nok til at rumme slangeklemmen og stabil nok til at understøtte en toptung tragt, vil fungere. For en enkelt tragt er et drikkeglas en passende holder. Enhver form for væv – ansigtsvæv, toiletpapir eller papirhåndklæder – kan bruges.
Mindre materiale i tragte eller justering af ventetiden for at forhindre hypoxi eller infektion
Hvis prøven har en meget høj koncentration af orme eller bakterier, nematoder kan begynde at dø af hypoxi eller infektion, før 12 timers inkubation er færdig. Hvis dette er en bekymring, forskeren kan kontrollere tragte tidligere eller forberede en ekstra tragt med en meget lille delsalmple af det tætbefolkede substrat.
Justering af NGM-pladepræparatet til eksperimentelle behov og begrænsninger
NGM plader kan tilberedes med uanset medier og fødekilde er passende til eksperimentet. Feltprotokollen, der er beskrevet ovenfor, er designet til at minimere bagagevægten. Afhængigt af bagagebegrænsninger og feltarbejde timing, bringe allerede hældte NGM plader – enten udarbejdet i laboratoriet eller købt kommercielt – kan være at foretrække frem for at hælde plader i marken.
Udførelse af tragtisolationerne i laboratoriet
Protokollen beskriver gennemførelsen af den komplette procedure under feltbetingelser for at fange nematodepopulationen, som den forekommer i naturen. For nogle forskningsmål kan det være tilstrækkeligt at isolere nematoder senere, efter at have rejst tilbage til laboratoriet med prøver i forseglede poser. Selv da giver Baermann-tragtmetoden en renere og komplet prøve af de overlevende nematoder end andre isolationsmetoder. Prøver i forseglede poser kan dog opleve udvælgelse under rejsen, da de udsættes for potentielle ekstremer af temperatur og hypoxi. Dette kan minimeres ved at udføre isolationer så hurtigt som muligt efter prøvesamlingen.
En almindelig alternativ metode til Baermann tragten indebærer at placere substratet direkte på en NGM plade og venter på orme til at kravle ud, hvilket enten er meget arbejdskrævende eller resulterer i ufuldstændig indsamling af befolkningen. Det giver også plader forurenet med mider og insektlarver. Baermann-tragtmetoden er en billig, lavteknologisk, lavarbejdsstrategi til hurtigt at adskille hele populationen af aktive orme fra deres substrat.
Baermann-tragtmetoden er ikke universelt anvendelig til indsamling af alle typer vilde nematoder. Nogle plantelevende nematoder tager meget længere tid end 12 timer at komme ud af deres substrat og vil være fraværende fra en dråbe frigivet for tidligt, mens nogle insektparasitter vil krybe til toppen af tragten i stedet for bunden og også undgå indsamling14. Alternativer til Baermann tragten enten kræver mere specialiseret udstyr eller mere arbejdskraft til at inddrive ormene. De kan dog stadig foretrækkes, hvis ovenstående forbehold er et problem for eksperimentet. Alternative muligheder, gennemgået af van Bezooijen14, omfatter tragtspraymetoden, som giver en konstant tåge af vand til tragte, tilsætning af ilt og tillader overløb af bakterier i suspension. Dette giver mulighed for en mere længere ekstraktionsperiode af nematoder fra planter. Blendercentrifugal flotationsmetoden genopretter langsomme, inaktive eller opadgående nematoder ved at adskille dem med deres specifikke tyngdekraft, Oostenbrink elutriatoren anvender en understrøm til at adskille aflejringssediment fra suspenderede nematoder, og Cobbs metode bruger en række sigte til at isolere nematoder ved deres størrelse, form og sedimenteringshastighed14. For at indsamle rhabditider producerer Baermann-tragten dog effektivt rene prøver hurtigt og med minimal indsats.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af NIH tilskud R35GM141906 og R21ES031364 og Damon Runyon Fellowship DRG-2371-19.
1 L glass bottle | NA | NA | Step 1 – vessel for making plate media |
1 mL pipette tips | any | NA | Step 1 – dispense worm media additives and seed plates |
1 mL pipetter | any | NA | Step 1 – dispense worm media additives and seed plates |
35 mm worm plates | Tritech | T3500 | Step 1 – worm plates |
4mm ID rubber tubing | Fisher | 14178A | Step 3 – part of the funnel |
60 mm worm plates | Greiner | 628161 | Step 1 – worm plates |
65 mm Funnel | Fisher | 22170156 | Step 3 – part of the funnel |
Calcium chloride | Fisher | C79-500 | Step 1 – worm plate medium |
Cooking pot | NA | NA | Step 1 – a water bath for melting the agar to pour plates |
E. coli strain OP50 | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | Step 1 – worm food |
Field microscope | OMAX | G223CS | Step 6 – for viewing worms in the field |
Fly vial storage tray | Azer Scientific | ES-260T | Step 3 – to build a platform to hold 12 funnels |
Hot plate or stove | NA | NA | Step 1 – to heat the water bath |
Kimwipes | KimberlyClark | 34120 | Step 4 – filter for the funnels |
LB media | Gibco | 10855021 | Step 1 – for growing OP50 |
Lighter | NA | NA | Step 6 – sterilize the worm pick |
Magnesium sulfate | Fisher | M63-500 | Step 1 – worm plate medium |
NGM-lite agar | USBiological | N1000 | Step 1 – worm plate medium |
Parafilm M wrapping film | Fisher | 13-374-10 | Step 6 – pack worm plates for travel |
Potassium phosphate dibasic | Fisher | BP363-500 | Step 1 – worm plate medium |
Potassium phosphate monobasic | Fisher | P285-3 | Step 1 – worm plate medium |
scalpel | NA | NA | Step 3 – cut holes for the funnels |
scissors | NA | NA | Step 3 – cut the rubber tubing |
Tape | NA | NA | Step 3 – tape the funnel holder together |
Tubing clamps | Fisher | 5869 | Step 3 – part of the funnel |
Worm pick | NA | NA | Step 6 – for isolating individual worms |
Ziplock-style storage bags | NA | NA | Step 2 – to bag a substrate sample |