Este protocolo describe un método para extraer eficientemente nematodos vivos de sustratos naturales en el campo.
Más allá de ser organismos modelo experimentales robustos, Caenorhabditis elegans y sus parientes también son animales reales que viven en la naturaleza. Los estudios de nematodos silvestres en sus entornos naturales son valiosos para comprender muchos aspectos de la biología, incluidos los regímenes selectivos en los que evolucionan los caracteres genómicos y fenotípicos distintivos, la base genética para la variación de rasgos complejos y la diversidad genética natural fundamental para todas las poblaciones animales. Este manuscrito describe un método simple y eficiente para extraer nematodos de sus sustratos naturales, incluyendo frutas podridas, flores, hongos, hojarasca y suelo. El método del embudo de Baermann, una técnica clásica de nematología, aísla selectivamente los nematodos activos de sus sustratos. Debido a que recupera casi todos los gusanos activos de la muestra, la técnica del embudo de Baermann permite la recuperación de genotipos raros y de crecimiento lento que coexisten con genotipos abundantes y de rápido crecimiento, que podrían perderse en los métodos de extracción que involucran múltiples generaciones de reproducción. La técnica también es muy adecuada para abordar cuestiones metagenéticas, genéticas de poblaciones y ecológicas. Captura a toda la población en una muestra simultáneamente, lo que permite una visión imparcial de la distribución natural de edades, sexos y genotipos. El protocolo permite el despliegue a escala en el campo, convirtiendo rápidamente los sustratos en placas de gusano, y los autores lo han validado a través del trabajo de campo en múltiples continentes.
Están surgiendo valiosos conocimientos biológicos a medida que los investigadores que estudian C. elegans en el laboratorio amplían su enfoque a C. elegans y nematodos rabdítidos relacionados en la naturaleza. Los estudios de nematodos silvestres sitúan los genes y genomas en su contexto natural, revelando funciones potencialmente oscurecidas por las condiciones de laboratorio1,2,3,4,5. Estos estudios generan información sobre el requisito previo para la evolución misma, la variación genética6,7,8,9,10. La variación genética natural capturada por muestras silvestres también proporciona incursiones en la base genética de muchos rasgos complejos11,12,13.
Al diseñar estudios que requieren el aislamiento de poblaciones naturales de nematodos, particularmente cuando se realiza trabajo de campo remoto, las consideraciones prácticas pasan a primer plano. Este protocolo tiene como objetivo aislar limpiamente poblaciones enteras de nematodos activos que se pueden cultivar en OP50 a partir de cebos o sustratos silvestres. El método es muy adecuado para extraer nematodos rabdíidos y diplogasteridos de vida libre, incluidos Caenorhabditis, Oscheius y Pristionchus.
Existen muchas técnicas para aislar nematodos de sus sustratos14,15. El enfoque más básico es colocar el sustrato directamente sobre una placa de nematodo medio, recogiendo animales a medida que se arrastran8,15. Este método requiere grandes cantidades de tiempo y trabajo si el objetivo es aislar todos los nematodos de una muestra. Las técnicas más sofisticadas aprovechan el peso, el tamaño, la movilidad o alguna combinación de estos de los animales14. Cada método tiene sus ventajas y desventajas en términos de configuración y rendimiento. También difieren en sus sesgos de muestreo y pueden seleccionar ciertos nematodos si los animales de la muestra varían a lo largo del eje del principio de separación del método.
El método del embudo de Baermann fue descrito por primera vez en 1917 por el médico holandés G. K. T. F. Baermann, quien inventó el dispositivo en Java mientras estudiaba los nematodos que habitan en el suelo, incluido el anquilostoma parásito16. El embudo de Baermann funciona basado en el principio de movilidad. El sustrato se coloca en un embudo forrado con un filtro de tela o papel (se utiliza un “Kimwipe” para este estudio, conocido como “toallita sin pelusa” en el protocolo actual) y se cierra sellado en la parte inferior. El embudo se llena con agua, sumergiendo la muestra mientras el filtro la separa de la salida sellada. Los nematodos activos en la muestra se liberan en el agua y nadan a través del filtro, finalmente se asientan en el fondo del embudo. Se abre la salida del embudo y se expulsa una gota de nematodos a una placa (Figura 1).
Figura 1: Resumen de la técnica del embudo de Baermann. (A) Recolección de una muestra rica en bacterias de un sitio de interés. (B) Sumergir la muestra en un embudo de Baermann y esperar a que los gusanos se retuerzan y se hundan. (C) Liberar una sola gota del embudo. (D) Mover hermafroditas individuales o hembras apareadas a placas separadas. Ilustración creada por Ramin Rahni. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
El embudo de Baermann no funcionará para todos los tipos de nematodos (consulte la sección Discusión para alternativas específicas) y es más adecuado para aquellos que son formas activas en el rango de tamaño de Caenorhabditis o más pequeñas14. Sin embargo, si un estudio puede usar el embudo de Baermann, hay muchas ventajas. El método es práctico en el campo, ya que requiere una configuración limitada, tiempo práctico y costo. El investigador se queda con una muestra limpia sin la obstrucción del sustrato en la placa, lo que facilita la recolección. El uso de un filtro también evita la contaminación de la placa por larvas de insectos o ácaros, que mastican placas o se alimentan de nematodos en la muestra. Lo más importante es que el embudo de Baermann extrae eficientemente casi toda la población del sustrato14, lo que puede ser necesario dependiendo del diseño del estudio. Por ejemplo, los investigadores interesados en contar la etapa o la distribución por sexo de las poblaciones silvestres, encontrar genotipos raros o de crecimiento lento, o muestrear nematodos no atraídos por OP50 podrían beneficiarse de este método. Esto es apropiado para los investigadores que estudian preguntas ecológicas17, genéticas de poblaciones18 o metagenéticas19, ya que el esquema de muestreo toma una instantánea de la población en el momento del muestreo.
El presente manuscrito describe un protocolo completo para aislar poblaciones de nematodos utilizando el embudo de Baermann y establecer líneas isofemale e isohermafroditas en el campo, utilizando equipos elegidos para facilitar el transporte. Para los investigadores que realizan trabajo de campo cerca de sus laboratorios, muchos de estos pasos pueden omitirse o simplificarse.
El principio central de este método es que los nematodos pasarán a través del tejido sumergido en agua, mientras que su sustrato y los contaminantes de invertebrados más grandes no lo harán. Los pasos críticos del protocolo son (1) recolectar un sustrato apropiado, (2) sumergir el sustrato, envuelto en un material filtrante, en agua, (3) recolectar gusanos que han pasado a través del filtro y se han hundido hasta el fondo del agua, y (4) aislar gusanos individuales para crear líneas isofemale o isohermafroditas. Todas las demás partes del método son susceptibles de modificación según sea necesario de acuerdo con los recursos disponibles, la naturaleza de los sustratos o los objetivos del trabajo de campo. Algunas modificaciones que vale la pena considerar son las siguientes.
Cebar a los gusanos plantando fruta
Si no hay un amplio suministro de material de podredumbre rico en bacterias que se encuentre en el sitio de campo, es posible que desee traer una muestra, como un trozo de manzana o tomate, para dejar que se pudra. Fije bien el cebo con unas pocas estacas para que los animales más grandes no los retiren y para que se pueda encontrar fácilmente más tarde para su recolección. Evite la luz solar directa, donde el cebo podría secarse antes de que se pudra.
Construcción de aparatos de embudo a partir de cualquier material disponible
Cualquier estructura con orificios lo suficientemente grandes como para acomodar la abrazadera del tubo y lo suficientemente estable como para soportar un embudo pesado superior funcionará. Para un solo embudo, un vaso para beber es un soporte adecuado. Se puede usar cualquier tipo de pañuelo de papel (pañuelo facial, papel higiénico o toallas de papel).
Poner menos material en los embudos, o ajustar el tiempo de espera, para prevenir la hipoxia o la infección
Si la muestra tiene una concentración muy alta de gusanos o bacterias, los nematodos pueden comenzar a morir de hipoxia o infección antes de que se complete la incubación de 12 h. Si esto es una preocupación, el investigador puede verificar los embudos antes o preparar un embudo adicional con una submuestra muy pequeña del sustrato altamente poblado.
Ajuste de la preparación de la placa NGM a las necesidades y restricciones experimentales
Las placas NGM se pueden preparar con cualquier medio y fuente de alimento que sea apropiado para el experimento. El protocolo de campo descrito anteriormente está diseñado para minimizar el peso del equipaje. Dependiendo de las limitaciones de equipaje y el tiempo de trabajo de campo, puede ser preferible traer placas NGM ya vertidas, ya sea preparadas en el laboratorio o compradas comercialmente, en lugar de verter placas en el campo.
Realización de los aislamientos de embudo en el laboratorio
El protocolo describe la realización del procedimiento completo en condiciones de campo para capturar la población de nematodos tal como ocurre en la naturaleza. Para algunos objetivos de investigación, puede ser suficiente aislar los nematodos más tarde, después de viajar de regreso al laboratorio con muestras en bolsas selladas. Incluso entonces, el método del embudo de Baermann proporciona una muestra más limpia y completa de los nematodos supervivientes que otros métodos de aislamiento. Sin embargo, las muestras en bolsas selladas pueden experimentar selección durante el viaje, ya que están expuestas a posibles extremos de temperatura e hipoxia. Esto se puede minimizar realizando aislamientos tan pronto como sea posible después de la recolección de muestras.
Un método alternativo común al embudo de Baermann consiste en colocar el sustrato directamente sobre una placa NGM y esperar a que los gusanos se arrastren, lo que es altamente laborioso o resulta en la recolección incompleta de la población. También produce placas contaminadas con ácaros y larvas de insectos. El método de embudo de Baermann es una estrategia de bajo costo, baja tecnología y baja mano de obra para separar rápidamente a toda la población de gusanos activos de su sustrato.
El método del embudo de Baermann no es universalmente aplicable para la recolección de todos los tipos de nematodos silvestres. Algunos nematodos que habitan en las plantas tardan mucho más de 12 h en emerger de su sustrato y estarán ausentes de una gota liberada demasiado pronto, mientras que algunos parásitos de insectos se arrastrarán hasta la parte superior del embudo en lugar de la parte inferior, evadiendo también la recolección14. Las alternativas al embudo de Baermann requieren equipos más especializados o más mano de obra para recuperar los gusanos. Sin embargo, aún pueden ser preferidos si las advertencias anteriores son un problema para el experimento. Las opciones alternativas, revisadas por van Bezooijen14, incluyen el método de pulverización de embudo, que proporciona una niebla constante de agua a los embudos, agregando oxígeno y permitiendo el desbordamiento de bacterias en suspensión. Esto permite un período de extracción más prolongado de nematodos de las plantas. El método de flotación centrífuga de la licuadora recupera nematodos de movimiento lento, inactivos o que se arrastran hacia arriba separándolos por su gravedad específica, elutriador Oostenbrink aplica una corriente subterránea para separar el sedimento de sedimentación de los nematodos suspendidos, y el método de Cobb utiliza una serie de tamices para aislar a los nematodos por su tamaño, forma y velocidad de sedimentación14. Sin embargo, para recolectar rabdítidos, el embudo de Baermann produce muestras limpias de manera efectiva rápidamente y con un esfuerzo mínimo.
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue apoyado por las subvenciones R35GM141906 y R21ES031364 de los NIH y la beca Damon Runyon DRG-2371-19.
1 L glass bottle | NA | NA | Step 1 – vessel for making plate media |
1 mL pipette tips | any | NA | Step 1 – dispense worm media additives and seed plates |
1 mL pipetter | any | NA | Step 1 – dispense worm media additives and seed plates |
35 mm worm plates | Tritech | T3500 | Step 1 – worm plates |
4mm ID rubber tubing | Fisher | 14178A | Step 3 – part of the funnel |
60 mm worm plates | Greiner | 628161 | Step 1 – worm plates |
65 mm Funnel | Fisher | 22170156 | Step 3 – part of the funnel |
Calcium chloride | Fisher | C79-500 | Step 1 – worm plate medium |
Cooking pot | NA | NA | Step 1 – a water bath for melting the agar to pour plates |
E. coli strain OP50 | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | Step 1 – worm food |
Field microscope | OMAX | G223CS | Step 6 – for viewing worms in the field |
Fly vial storage tray | Azer Scientific | ES-260T | Step 3 – to build a platform to hold 12 funnels |
Hot plate or stove | NA | NA | Step 1 – to heat the water bath |
Kimwipes | KimberlyClark | 34120 | Step 4 – filter for the funnels |
LB media | Gibco | 10855021 | Step 1 – for growing OP50 |
Lighter | NA | NA | Step 6 – sterilize the worm pick |
Magnesium sulfate | Fisher | M63-500 | Step 1 – worm plate medium |
NGM-lite agar | USBiological | N1000 | Step 1 – worm plate medium |
Parafilm M wrapping film | Fisher | 13-374-10 | Step 6 – pack worm plates for travel |
Potassium phosphate dibasic | Fisher | BP363-500 | Step 1 – worm plate medium |
Potassium phosphate monobasic | Fisher | P285-3 | Step 1 – worm plate medium |
scalpel | NA | NA | Step 3 – cut holes for the funnels |
scissors | NA | NA | Step 3 – cut the rubber tubing |
Tape | NA | NA | Step 3 – tape the funnel holder together |
Tubing clamps | Fisher | 5869 | Step 3 – part of the funnel |
Worm pick | NA | NA | Step 6 – for isolating individual worms |
Ziplock-style storage bags | NA | NA | Step 2 – to bag a substrate sample |