Induktion von Darmentzündungen durch adoptive Übertragung von CBir1 TCR transgenen CD4+ T-Zellen auf immundefiziente Mäuse
Summary
In diesem Protokoll wird ein Darmmikrobiota-Antigen-spezifisches T-Zell-Adoptivtransfer-Kolitis-Modell beschrieben. CD4+ T-Zellen werden aus transgenen CBir1 TCR-Mäusen isoliert. Diese sind spezifisch für ein immundominantes Darmmikrobiota-Antigen CBir1 Flagellin, das in Empfänger-Rag1-/- Mäuse übertragen wird, was zu einer Darmentzündung führt.
Abstract
Mit der Zunahme der Inzidenz stellen entzündliche Darmerkrankungen (IBD), bei denen es sich um chronische Erkrankungen des Magen-Darm-Trakts handelt, eine erhebliche gesundheitliche und finanzielle Belastung für den Einzelnen und die Gesellschaft dar. Daher ist es wichtig, die Mechanismen zu untersuchen, die der Pathogenese und Entwicklung von IBD zugrunde liegen. Hier wird ein Darmmikrobiota-Antigen-spezifisches T-Zell-Transfer-Kolitis-Modell beschrieben. CBir1 Flagellin wurde als immundominantes bakterielles Darmantigen bei experimenteller Kolitis und Patienten mit Morbus Crohn anerkannt. CBir1 TCR transgene naϊve CD4+ T-Zellen, spezifisch für CBir1-Flagellin, können nach adoptivem Transfer in immundefizierende Rag1-/- Mäuse eine chronische Kolitis induzieren. Der Schweregrad der Erkrankung wird durch Histopathologie beurteilt. Die CD4+ T-Zell-Phänotypen in der Kolonlamina propria werden ebenfalls bestimmt. Dieses Modell ähnelt stark der Entwicklung von IBD, die ein ideales mausines Modell für die Untersuchung der Mechanismen bietet, die die Pathogenese von IBD antreiben, und das Testen der potenziellen Medikamente zur Behandlung von IBD.
Introduction
Entzündliche Darmerkrankungen (IBD), vor allem Morbus Crohn (CD) und Colitis ulcerosa (UC), sind durch chronische, schubförmig remittierende Entzündungen des Magen-Darm-Traktes gekennzeichnet, von denen weltweit Millionen betroffen sind1. Mehrere Faktoren wurden an der Entwicklung und Pathogenese von IBD beteiligt, darunter genetische Anfälligkeit, Darmmikrobiota, Immunantworten, Ernährung und Lebensstil2. Der genaue Mechanismus von IBD ist jedoch noch nicht vollständig verstanden.
Eines der besonderen Interessen ist die Wechselwirkung zwischen Darmmikrobiota und Wirtsimmunantworten bei der Regulierung von Darmentzündungen3. Die Darmmikrobiota liefert eine Reihe von immunstimulierenden Molekülen und Antigenen, die Immunantworten aktivieren können4. Während das Gleichgewicht zwischen Effektor-T-Zellen und regulatorischen T-Zellen (Tregs) für die Aufrechterhaltung der Darmhomöostase entscheidend ist, trägt die übermäßige CD4+ T-Zell-Reaktion der Darmschleimhaut auf Darmmikrobiota-Antigene zur Darmentzündung bei5,6,7. Als immundominantes Darmmikrobiota-Antigen wurde CBir1-Flagellin mit der Pathogenese des menschlichen CD8,9 in Verbindung gebracht. Darüber hinaus induziert der Transfer von transgenen (Tg) CBir1 TCR-T-Zellen bei immundefizienten Mäusen6 eine Darmentzündung, die der menschlichen IBD sehr ähnlich ist, was darauf hindeutet, dass dieses T-Zell-Transfermodell dazu beiträgt, die Mechanismen der menschlichen IBD zu untersuchen.
Diese Arbeit beschreibt das detaillierte Protokoll der Induktion von Kolitis in Rag1-/- Mäusen durch adoptive Übertragung von CBir1 TCR Tg naϊve CD4+ T-Zellen und die Beurteilung der Schwere der Erkrankung. Außerdem werden die erwarteten Ergebnisse gezeigt und die kritischen Schritte des Verfahrens und der Fehlerbehebung diskutiert, die den Forschern helfen werden, die Mechanismen der Pathogenese von Darmentzündungen zu untersuchen und die potenziellen Medikamente zur Behandlung von IBD zu testen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Obwohl jeder Schritt für die Reproduzierbarkeit dieses Colitis-Modells unerlässlich ist, gibt es mehrere kritische Schritte. Die Empfänger-Rag-/- Mäuse sollten ausreichend lebensfähige naϊve CD4+ T-Zellen erhalten, um eine Darmentzündung auszulösen. Wir verwendeten Milz für die Isolierung von naiven CD4+ T-Zellen anstelle von MLNs. Weil die Ausbeute an naiven CD4+ T-Zellen in MLNs viel geringer ist als in Milzen. CD62L wird in naiven T-Zellen hoch exprimiert, …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde zum Teil durch die National Institutes of Health Grants DK125011, AI150210 und DK124132, den University of Texas System STARs Award (Y.C.) und den James W. McLaughlin Fellowship Fund der University of Texas Medical Branch in Galveston (W.Y.) unterstützt. Abbildung 1 wurde mit BioRender.com erstellt.
Materials
| 0.22 µm vacuum-driven disposable bottle top filter | MilliporeSigma | SCGPS05RE | |
| 100x Penicillin-Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| 100-µm strainer | BD Biosciences | 352360 | |
| 3-mL Transfer Pipette | Fisherbrand | 13-711-9CM | |
| Anti-Mouse CD16/32 | Biolegend | 101302 | |
| Anti-Mouse CD25-Percp/Cy5.5 | Biolegend | 102030 | |
| Anti-mouse CD3-Percp/Cy5.5 | Biolegend | 100327 | |
| Anti-Mouse CD4 APC | Biolegend | 100516 | |
| Anti-Mouse CD4 Magnetic Particles | BD Biosciences | 551539 | |
| Anti-Mouse CD4-BV421 | Biolegend | 100544 | |
| Anti-Mouse CD62L-PE | Biolegend | 104408 | |
| Anti-Mouse Foxp3-PE | ThermoFisher | 12-5773-82 | |
| Anti-Mouse IFNγ-FITC | Biolegend | 505806 | |
| Anti-Mouse IL-17A-PE/Cy7 | Biolegend | 506922 | |
| Automated Cell Counter | Bio-rad | TC20 | |
| Brefeldin A | BD Biosciences | 555029 | |
| BSA | Fisher Bioreagents | BP1600-1 | |
| C tube | Miltenyi | 130-093-237 | |
| Cell Separation Magnet | BD Biosciences | 552311 | |
| Collagenase IV | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Dissociator Machine | Miltenyi | 130-096-427 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | ||
| EDTA | Corning | 46-034-CI | |
| EDTA (0.5 M, PH 8.0) | Corning | 46-034-CI | |
| FBS | R&D Systems | S11550 | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | LSD Fortessa | |
| Heat Lamp | CoverShield | BR40 | |
| Hematoxylin and Eosin (H&E) Stain Kit | Abcam | ab245880 | |
| Insulin Syringes | BD Biosciences | 329412 | |
| Ionomycin | ThermoFisher | I24222 | |
| Live/dead Fixable Near-IR Dead Cell Stain kit | ThermoFisher | L10119 | |
| MaxQ 6000 Incubated/Refrigerated Stackable Shakers | ThermoFisher | SHKE6000 | |
| NH4Cl | Thermo Scientific | A687-500 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Phorbol-12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| RPMI 1640 Medium | Cytiva HyClone | SH3002702 | |
| Sorter | BD Biosciences | Arial Fusion | |
| Tissue Automatic Processor | ThermoFisher | STP120 | |
| Tissue Embedding/Processing Cassette | Fisher Healthcare | 22048142 | |
| Tris Base | Thermo Scientific | BP154-1 | |
| True-Nuclear Transcription Factor Buffer Set (including Perm Buffer) | Biolegend | 424401 |
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